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恒遠(yuǎn)展示W(wǎng)B實(shí)驗(yàn)具體操作步驟賞析
閱讀：2050 發(fā)布時(shí)間：2015-4-20Western Blot技術(shù)服務(wù)Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。我司本周展示W(wǎng)B實(shí)驗(yàn)具體操作步驟。歡迎聚焦賞析，您可將您的建議或意見(jiàn)告知我們，真誠(chéng)為您服務(wù)，上海恒遠(yuǎn)生物歡迎您的光臨。
因上海恒遠(yuǎn)WB實(shí)驗(yàn)為代測(cè)服務(wù)。我司服務(wù)流程如下：
1.客戶提供一抗，是進(jìn)口的抗體，本公司可代購(gòu)
2.提取樣本總蛋白，進(jìn)行總蛋白定量
3.根據(jù)總蛋白定量的結(jié)果，微調(diào)各個(gè)樣本間濃度差異，高溫變性，加入loading buffer，上樣跑膠，以及轉(zhuǎn)膜顯色等步驟
4.利用軟件對(duì)所得膠片進(jìn)行掃描，用相對(duì)定量方法進(jìn)行定量分析時(shí)，要對(duì)管家蛋白等參比蛋白進(jìn)行同樣操作，用所得到的值進(jìn)行蛋白量的校正，zui后求得目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量
5.提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告：包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及western blot結(jié)果的相關(guān)圖表 。以下為我司具體做實(shí)驗(yàn)的操作步驟，歡迎點(diǎn)擊閱讀：
【操作步驟】
1）按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。
2）按表1配制分離膠液體并脫氣，然后加入10％的過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表1 聚丙烯酰胺分離膠的配制
試劑成分配制不同濃度分離膠所需試劑（ml）
5%8%10%12%15%
Acry:Bis （30:0.8）2.504.005.006.007.50
4×Tris?Cl/SDS, pH8.83.753.753.753.75
H2O8.757.256.255.253.25
10%過(guò)硫酸銨0.050.050.050.050.05
TEMED0.010.010.010.010.01
按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5％的凝膠可用于60～200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分離，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。
3）用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入于玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少于10μl不需灌制積層膠。
4）用另一根已斯德吸管，先從一邊的墊片，再?gòu)牧硪贿厜|片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合后，可見(jiàn)在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問(wèn)題在于過(guò)硫酸按或TEMED，或兩者都有。
5）傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸干。
6）按表2配制積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。
表2 聚丙烯酰胺積層膠的配制
GEL%（3.9%） Total （10.05ml）
Acry:Bis（30:0.8） 1.30 ml
4×Tris?Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
H2O 6.10 ml
10%過(guò)硫酸銨 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7）將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時(shí)，再補(bǔ)加積層膠液體充盈剩余空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8）在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1（v/v）稀釋待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，于100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質(zhì)沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之，并同樣在100℃煮沸5-10min。按供應(yīng)商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物。
對(duì)于0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過(guò)20μl 為宜。用考馬斯亮藍(lán)染色法顯跡，成分很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。采用銀染顯跡時(shí)，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的復(fù)雜程度在小于20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。
2×SDS加樣緩沖液（loading buffer）配制：
成分 體積 （ml）
0.5M Tris?Cl （pH6.8） 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H2O至總體積50 ml，分裝
*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，并以此緩沖液充滿之。
10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室（上槽），同時(shí)往下緩沖液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩沖液。
11）將固定于上槽的凝膠板放入下槽中，并往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒(méi)凝膠的加樣孔。
12）用帶平嘴針頭的50μl注射器將同樣濃度的蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對(duì)照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴(kuò)散。
13）再往上槽加入余下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。
14）連接電源，對(duì)于0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍(lán)染料從積層膠進(jìn)入分離膠，再將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止。
15）關(guān)閉電源并撤去連接的導(dǎo)線，棄去電泳緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。
16）將凝膠定位以便識(shí)別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來(lái)，放在一疊吸水紙或紙巾上。
17）小心將封邊的墊片抽出一半，并以此為杠桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來(lái)。
18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認(rèn)出加樣次序，接著就可進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
19）轉(zhuǎn)膜：將凝膠面與負(fù)極相連，硝酸纖維素膜與正極相連。（100V，1小時(shí)）要放于4℃。
20）清洗：將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。搖床搖動(dòng)。
21）封閉
22）一抗孵育：一抗用TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時(shí)，（或4℃過(guò)一夜）搖床搖動(dòng)。
23）清洗：將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。
24）二抗孵育：二抗用TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時(shí)，搖床搖動(dòng)。
25）清洗：同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分鐘，以洗去膜上的Tween 20，因?yàn)樗梢宰璧K底物的沉積。
26）顯色
按如下配方配制顯色液：
1mL水+1滴（大約50微升）試劑A（之后混勻）+1滴試劑B+1滴試劑C
將硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，立即放入去離子水中終止反應(yīng)。