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 原因

解決方法

一抗與膜的孵育時間不夠

磷酸化蛋白抗體是針對于特定的一個或兩個磷酸化位點的，特異性很高但往往比常規(guī)的抗體能得到的信號要弱一些。用合適的緩沖液稀釋，并在4°C與膜孵育過一夜，對于磷酸化抗體來說很關(guān)鍵。

電泳后的蛋白沒有全部轉(zhuǎn)移到膜上

增加轉(zhuǎn)膜所用的時間或電壓。通過預染分子量標準品判斷轉(zhuǎn)膜是否*，不建議用染料染膜來觀察，因為這樣會抑制化學發(fā)光反應(yīng)。

膜的封閉時間過長

在牛奶中封閉時間太長會遮蔽抗原表位并會把轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白置換下來。封閉只需1小時（決不要過一夜封閉）。

目的基因的表達量太少，低于檢測底限。

每條泳道中上樣總蛋白20 μg通常就足夠了。如果目的基因的表達水平較低，則可以增加上樣量。或是在做SDS-PAGE之前先做免疫沉淀。嘗試其他細胞系或是高表達該蛋白的組織樣品。

二抗太弱。

換用其他批次的二抗或是提高二抗的濃度。

LumiGLO^?試劑沒有按規(guī)定配制或是儲存液試劑A和B已經(jīng)相互污染。

重新配制LumiGLO^?試劑。用抗生物素-HRP和生物素標記的分子量標準品作為化學發(fā)光檢測反應(yīng)的陽性對照。