化工儀器網(wǎng)
公司動(dòng)態(tài)
生物分離技術(shù)在多肽蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用
閱讀：2272 發(fā)布時(shí)間：2012-9-4摘要：蛋白質(zhì)是生物體的重要組成部分，在現(xiàn)代生物制藥領(lǐng)域有著重要的作用，本文介紹了現(xiàn)代生物分離技術(shù)反膠束萃取、雙水相萃取和電泳在多肽蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用和現(xiàn)狀。
關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì) 反膠束萃取 雙水相萃取 電泳
一、前言
隨著基因工程和細(xì)胞工程的發(fā)展，盡管傳統(tǒng)的分離方法（如溶劑萃取技術(shù)）已在抗生素等物質(zhì)的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，并顯示出優(yōu)良的分離性能，但它難以提取和分離蛋白質(zhì)。其主要原因有兩個(gè)：
被分離對(duì)象—蛋白質(zhì)等在40~500C便不穩(wěn)定，開(kāi)始變性，而且絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都不溶于有機(jī)溶劑，若使蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸，也會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性；
萃取劑問(wèn)題—蛋白質(zhì)分子表面帶有許多電荷，普通的離子締合型萃取劑很難奏效。
新興的生物分離技術(shù)反膠束萃取、雙水相萃取和電泳在蛋白質(zhì)的分離純化方面顯示出了自身的優(yōu)勢(shì)，并展現(xiàn)出了廣闊的前景。
二、反膠束萃取
2.1 反膠束萃取技術(shù)及其萃取蛋白質(zhì)的機(jī)理
2.1.1 反膠束及其萃取原理
反膠束（reversed micelle）是雙親物質(zhì)在非極性有機(jī)溶劑中自發(fā)聚集體，又稱為反膠團(tuán)、逆膠束（inverse micelle）。雙親物質(zhì)的這種膠團(tuán)化過(guò)程的自由能變化主要來(lái)源于雙親分子之間偶極子－偶極子相互作用，除此之外，平動(dòng)能和轉(zhuǎn)動(dòng)能的丟失以及氫鍵或金屬配位鍵的形成等都可能參與這種膠團(tuán)化過(guò)程。
在反膠束內(nèi)部，雙親分子極性頭基相互聚集形成一個(gè)“極性核”，可以增溶水、蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)，增溶了大量水的反膠束體系即為微乳液（microemulsion）。水在反膠束中以兩種形式存在：自由水（free water）和結(jié)合水（bound water），后者由于受到雙親分子極性頭基的束縛，具有與主體水（普通水）不同的物化性質(zhì)，如粘度增大，介電常數(shù)減小，氫鍵形成的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞等。
對(duì)于增溶了物質(zhì)（如水，蛋白質(zhì)等）的反膠束基本上都認(rèn)為是單層雙親分子聚集的近似球體，并忽視膠束之間的相互作用。事實(shí)上，反膠束體系處于不停的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，反膠束之間的碰撞頻率為109~1011次/s，而且反膠束中的增溶物在頻繁的交換。
2.1.2反膠束萃取蛋白質(zhì)的機(jī)理
蛋白質(zhì)溶解于小水池中（正萃，或稱萃?。?，其周圍有一層水膜及表面活性劑極性頭的保護(hù)，使其避免與有機(jī)溶劑接觸而失活。改變pH、鹽濃度等條件蛋白質(zhì)又可回到水相（反萃），實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取分離、純化目的。反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的機(jī)理目前尚不十分清楚。一般認(rèn)為，萃取過(guò)程是靜電力、疏水力、空間力、親和力或幾種力協(xié)同作用的結(jié)果，其中蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭間的靜電相互作用是主要推動(dòng)力。根據(jù)所用表面活性劑類型，通過(guò)控制水相pH高于或低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI），達(dá)到正萃反萃的目的。
2.2 反膠束萃取蛋白質(zhì)的應(yīng)用
2.2.1 同時(shí)提取蛋白質(zhì)和油脂：陳復(fù)生等在AO-異辛烷反膠束同時(shí)萃取花生蛋白和花生油的過(guò)程，采用正交試驗(yàn)分析討論了影響萃取的主要因素得到了*萃取工業(yè)條件。萃取后，油進(jìn)入有機(jī)相而蛋白質(zhì)溶入反膠束中。克服了傳統(tǒng)方法工藝復(fù)雜，得率低，蛋白質(zhì)容易變性的缺點(diǎn)。同時(shí)用蒸餾方法將油和烴分開(kāi)，提煉出了油脂。
2.2.2 分離蛋白質(zhì)混合物：Chang在Aliquat336/異辛烷反膠束分離枯草桿菌中兩種酶——淀粉酶和中性蛋白酶時(shí)，通過(guò)加入助表面活性劑丁醇，有效地分離了這兩種不同等電點(diǎn)的酶。
2.2.3 從發(fā)酵液中分離和提純酶：Krishnakant用AOT/異辛烷體系從土豆發(fā)酵液中提取酸性磷酸酶，在pH值810，萃取水相與有機(jī)相體積比為3：1，反萃水相與有機(jī)相體積比為1：1時(shí)得到zui大活性的酸性磷酸酶。Sun在CB-卵磷脂親和反膠束中加入Tween85，直接從雞蛋清中提取了溶菌酶。而該反膠束系統(tǒng)還可以回收后反復(fù)使用。
三、雙水相萃取
3.1 雙水相萃取的原理及特點(diǎn)
3.1.1 雙水相萃取的原理
雙水相萃取與水-有機(jī)相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，但萃取體系的性質(zhì)不同。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的濃度不同。分配系數(shù)K等于物質(zhì)在兩相的濃度比，由于各種物質(zhì)的K值不同，可利用雙水相萃取體系對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離。
3.1.2 雙水相萃取的特點(diǎn)
雙水相體系萃取具有如下特點(diǎn)：（1）含水量高（70%~90%），是在接近生理環(huán)境的溫度和體系中進(jìn)行萃取，不會(huì)引起生物活性物質(zhì)失活或變性；（2）分相時(shí)間短，自然分相時(shí)間一般為5~15min；（3）界面張力小（10-7~10-4mN/m），有助于強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞；（4）不存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題；（5）大量雜質(zhì)能與所有固體物質(zhì)一同除去，使分離過(guò)程更經(jīng)濟(jì)；（6）易于工程放大和連續(xù)操作。由于雙水相萃取具有上述優(yōu)點(diǎn)，因此，被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。
3.2 雙水相萃取在分離和提取各種蛋白質(zhì)（酶）上的應(yīng)用
用聚乙二醇（PEG）/羥丙基淀粉酶（Reppal PEG）體系經(jīng)兩步法可從黃豆中分離磷酸甘油酸激酶（PGK）和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。在黃豆勻漿中加入PEG4000，可絮凝細(xì)胞碎片及大部分雜蛋白。在上清液中加入PEG4000（12%）-ReppalPES（40%），PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取過(guò)程的放大采用離心傾析機(jī)連續(xù)處理勻漿液，用離心萃取器完成雙水相體系的兩相分離，整個(gè)工藝具有處理量大、接觸時(shí)間短、酶收率高的特點(diǎn)。用PEG/（NH4）2SO4雙水相體系，經(jīng)一次萃取從A-淀粉酶發(fā)酵液中分離提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取zui適宜條件為PEG1000（15%）-（NH4）2SO4（20%），pH=8，α-淀粉酶收率為90%，分配系數(shù)為19.6，蛋白酶的分離系數(shù)高達(dá)15.1。比活率為原發(fā)酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通過(guò)向萃取相（上相）中加進(jìn)適當(dāng)濃度的（NH4）2SO4可達(dá)到反萃取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著（NH4）2SO4濃度的增加，雙水相體系兩相間固體物析出量也增加。固體沉淀物既可干燥后生產(chǎn)工業(yè)級(jí)酶制劑，也可將固體物加水溶解后用有機(jī)溶劑沉淀法食品級(jí)酶制劑.
Harris用雙水相體系從羊奶中純化蛋白，研究了牛血清清蛋白（OSA）、牛酪蛋白、β-乳球蛋白在PEG/磷酸鹽體系中的分配以及PEG相對(duì)分子質(zhì)量、pH值和鹽的加入對(duì)3種蛋白分配的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明。增加NaCl濃度，可提高分配系數(shù)，*pH為5。對(duì)OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系數(shù)。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白質(zhì)和類囊體薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲?；暇厶呛臀祯；暇厶蔷哂惺杷?。疏水基影響氨基酸、蛋白質(zhì)和薄膜泡囊在雙水相體系中的分配，在只有磷酸鹽緩沖溶液的PEG8000/葡聚糖雙水相體系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲?；暇厶牵ㄈ〈潭葹?.054）或戊?；暇厶牵ㄈ〈潭葹?.12）時(shí)，β-半乳糖苷酶的分配系數(shù)就降低了100倍。在對(duì)牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳球蛋白的分配進(jìn)行的觀察中發(fā)現(xiàn)具有相似的現(xiàn)象。類囊體薄膜泡囊的分配受疏水基的影響特別大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物雙水相中，利用逆流分配可對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行分級(jí)分離。Miyuki在PEG/K3PO4雙水相體系中用兩步法對(duì)葡糖淀粉酶進(jìn)行了萃取純化。用*步萃取后含有酶的下相和PEG組成雙水相作為第二步萃取體系，稱作兩步法。葡糖淀粉酶的*分配條件是PEG4000（*步）、PEG1500（第二步），pH=7，純化系數(shù)提高了3倍。
四、電泳
4.1 電泳的定義原理及優(yōu)點(diǎn)
在電場(chǎng)作用下，帶電顆粒在溶液中的運(yùn)動(dòng)稱為電泳，在小離子的情況下，稱為離子導(dǎo)電性現(xiàn)象。這是一種不*的電解現(xiàn)象，所需的產(chǎn)物不是直接釋放在電極上，而是使它們不同的運(yùn)動(dòng)同步受阻在兩電極間的中間位置上。它能分離非常類似的物質(zhì)，包括不同的蛋白質(zhì)，提高了分折和制備的效果，特別是在紙上和在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上區(qū)帶電泳的采用。
電泳是分離生化物質(zhì)的一種有效的和多功能的方法。在電場(chǎng)的作用下，電泳流動(dòng)性的差別，可用于許多物質(zhì)的分離，其中包括離子、膠體、細(xì)胞物質(zhì)、細(xì)胞器以及全細(xì)胞。以前電泳僅用于常規(guī)的生化分析，但近期在制備電泳上取得了許多重大的進(jìn)展（如低容積高價(jià)值的化合物或試劑的生產(chǎn)中）。
電泳分離的優(yōu)點(diǎn)是分辨率高和能保持產(chǎn)物的生物活性。
4.2 毛細(xì)管電泳（CE）
毛細(xì)管電泳是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳具有多種分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細(xì)管等速電泳（CITP）、毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）等。應(yīng)用毛細(xì)管電泳分離多肽類物質(zhì)具有柱效高、分析時(shí)間短、所用樣品量和試劑少等優(yōu)點(diǎn)。黃志東等使用MECC在8min分離了7種肽類物質(zhì)。
與液相色譜相比，CE的制備總量低，只適用于微量制備；對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，因此CE被用來(lái)作為收集非常純的單一餾分的微量制備手段。
4.3 二維凝膠電泳技術(shù)（two－dimensional del electrophoresis，2-DE）
2-DE是1975年由O’Farrell建立的，其基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的二個(gè)一級(jí)特性，將蛋白質(zhì)的混合物在等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF）中進(jìn)行*維的分離，然后轉(zhuǎn)入十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行第二維分離，分離膠經(jīng)顯色后，通過(guò)商業(yè)化的計(jì)算機(jī)軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析處理。
經(jīng)典的22DE采用載體兩性電解質(zhì)（carrier ampholyte CA）進(jìn)行等電聚焦，這種方法重復(fù)性差、pH梯度不穩(wěn)定，因此，限制了2－DE的廣泛應(yīng)用。1988年，固相化pH梯度膠條（immobilized PH gradients， IPGs）技術(shù)的建立，克服了CA的缺點(diǎn)。IPGs技術(shù)的應(yīng)用為各實(shí)驗(yàn)室間的交流、蛋白質(zhì)圖譜及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立奠定了基礎(chǔ)。
生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)除數(shù)量多之外，還具有不同的豐度、相對(duì)分子質(zhì)量、酸堿度以及可溶性、疏水性的不同，因此2－DE的一次分離不能*呈現(xiàn)所有的蛋白質(zhì)，尤其對(duì)于組織和細(xì)胞內(nèi)低豐度蛋白質(zhì)、極酸和極堿性區(qū)蛋白質(zhì)、高分子質(zhì)量區(qū)蛋白以及膜蛋白等。針對(duì)以上缺點(diǎn)，研究者對(duì)2－DE進(jìn)行了許多改進(jìn)，如采用窄范圍的pH膠條（2～3pH單位和1pH單位）、預(yù)分離技術(shù)、預(yù)分離技術(shù)與窄范圍pH膠條的聯(lián)合應(yīng)用等。這些技術(shù)的應(yīng)用改善了2－DE的分辨率，提高了低豐度蛋白質(zhì)和膜蛋白的檢出率。
二維差異凝膠電泳（two2－dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）是二維電泳技術(shù)的另一個(gè)突破.該技術(shù)應(yīng)用兩種不同的熒光染料Cy3和Cy5，分別標(biāo)記不同的蛋白質(zhì)樣品，然后將兩種樣品等量混合，在同一2-DE中分離.通過(guò)在同一塊膠上對(duì)比一個(gè)蛋白點(diǎn)處兩種不同熒光的強(qiáng)度，比較兩種狀態(tài)下特定蛋白質(zhì)豐度變化、蛋白質(zhì)的缺失或是否有新蛋白質(zhì)的出現(xiàn)等。DIGE克服了二維電泳過(guò)程中不同凝膠間重復(fù)性差的問(wèn)題；同時(shí)可以在同一塊膠上更直觀地觀察兩種樣品蛋白質(zhì)的差異表達(dá)并對(duì)其定量。
五、結(jié)論
隨著生物分離技術(shù)的發(fā)展、新的生物分離技術(shù)的不斷出現(xiàn)，為蛋白質(zhì)的分離提供了許多新的方法和途徑。但其中仍然有許多問(wèn)題，如成本過(guò)高，分離量少，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等。還需要我們不懈努力改進(jìn)。