化工儀器網(wǎng)
公司動態(tài)
大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表達
閱讀：1620 發(fā)布時間：2012-10-25大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表達
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展, 基因治療已成為繼腫瘤的手術(shù)治療和放療、化療后的又一新途徑。特別是自殺基因治療為目前國內(nèi)外研究的熱點之一。大腸桿菌DeoD基因編碼的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能將無毒的前體藥脫氧腺苷類似物分解產(chǎn)生劇毒的腺嘌呤類似物, 通過抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,而引起細胞死亡。同時它能夠通過產(chǎn)生*的旁觀者效應(yīng),不僅使轉(zhuǎn)基因細胞被殺死,而且大量未轉(zhuǎn)基因的細胞亦被殺死[1,2]。本文對大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）基因進行分子克隆并構(gòu)建到pcDNA3.1真核表達載體中, 并獲得穩(wěn)定表達EPNP基因的MKN45細胞克隆,為今后進一步研究自殺基因在胃癌基因治療中的應(yīng)用創(chuàng)造條件。
1 材料和方法
1.1 載體與菌株 大腸桿菌JM109和真核表達載體pcDNA3.1均購自Invitrogen公司?？寺≥d體pMD18T購自大連寶生物公司。
1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Bam HI 和Hind III、T4DNA鏈接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker均購自大連寶生物公司；凝膠DNA提取Kit和PCR產(chǎn)物純化Kit購自Promega公司；LipofectaminTM Reagent、Geneticin（G418 Sulfate） 及MePdR為Invitrogen公司產(chǎn)品；IPTG和Xgal購自上海生物工程公司。實驗所用試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。
1.3 目的基因的克隆 ①引物設(shè)計: 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的EPNP基因的核苷酸序列設(shè)計一對引物。為方便克隆,在上游引物和下游引物的5′端分別引入Hind III 和Bam HI 酶切位點。上游引物：5’ –ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：TATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取: 大腸桿菌JM109基因組DNA的提取,按文獻[3]方法進行。③PCR: 94℃變性5min進入循環(huán),94℃,60秒,56℃,60秒,72℃,120秒,經(jīng)30個循環(huán)擴增后72℃延伸10min。取10μl PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定。PCR產(chǎn)物的回收按PCR產(chǎn)物純化Kit上的說明進行。回收產(chǎn)物保存于20℃?zhèn)溆谩?/span>
1.4 PCR產(chǎn)物的克隆及測序 TA克隆載體pMD18T與膠回收純化的PCR產(chǎn)物按1∶3（摩爾比）的比例在T4DNA連接酶作用下進行連接, 16℃反應(yīng)16ｈ。取10μｌ連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細菌,將轉(zhuǎn)化的菌液涂在Xgal 處理過的含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)12ｈ,在長出藍、白克隆的LB平板上挑取白色克隆進行少量擴增、質(zhì)粒小提, 用酶切初步鑒定陽性細菌克隆, 將酶切鑒定正確的細菌克隆送交大連寶生物公司測序。
1.5 真核表達載體pcDNA3.1EPNP的構(gòu)建和鑒定 測序正確的質(zhì)粒pMD18T用限制酶Hind III和Bam HI進行雙酶切反應(yīng), 純化回收約716ｂp大小的目的片段; 質(zhì)粒pcDNA3.1也進行Hind III和Bam HI雙酶切,純化回收大片段。用T4DNA連接酶連接目的片段和線性化的空質(zhì)粒pcDNA3.1, 16℃反應(yīng)16ｈ。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌JM109,將轉(zhuǎn)化的菌液涂在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)12ｈ,挑取6個陽性克隆進行少量擴增、質(zhì)粒小抽,以Hind III和BamHI雙酶切鑒定陽性細菌克隆。
1.6 真核表達載體pcDNA3.1EPNP的轉(zhuǎn)染 將重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細菌JM109及以空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)化的菌株,在LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)18ｈ,按照質(zhì)粒提取說明分別提取pcDNA3.1EPNP和pcDNA3.1,經(jīng)紫外分光光度儀測定A260nm定量。按照LipofectaminTM Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明轉(zhuǎn)染胃癌細胞MKN45。
1.7 RTPCR 鑒定EPNP基因在MKN45細胞中的穩(wěn)定表達 待具有Ｇ418抗性的MKN45細胞克隆長滿6孔板時,抽提轉(zhuǎn)染pcDNA3.1EPNP細胞（MKN45/pcDNA3.1EPNP）和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1細胞（MKN45/pcDNA3.1）總RNA, 進行RTPCR反應(yīng), 鑒定EPNP和內(nèi)參照GAPDH mRNA的表達。
1.8 MTT法檢測MePdR對轉(zhuǎn)染ECPNP細胞的細胞毒作用 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1EPNP細胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1細胞和親本細胞以1×104/孔接種于96孔板，24h后加入不同濃度的MePdR使終濃度分別為107、2.5×107、5×107、106、105mol/L，以不加藥的未轉(zhuǎn)染細胞作對照。每實驗組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)72h后加入MTT 20μl（5μg/ml）,4h后棄上清加入DMSO溶解，震蕩10min后，酶標(biāo)儀測490nm處吸光度（A）值，進而按下式計算各組細胞存活率：存活率=實驗組A值/對照組A值×100%
2 結(jié)果
2.1 目的基因克隆及測序
以大腸桿菌基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增出一條約716bp的特異條帶,將純化的PCR產(chǎn)物克隆于載體pMD18T中，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細菌。藍白篩選,隨機挑取6個白色菌落提取質(zhì)粒,用Hind III和BamHI雙酶切后,釋放出716bp左右的片段,見圖1。測序結(jié)果經(jīng)與Genbank中登錄的序列相比較,序列*正確 （本文資料未列出），說明已成功擴增了大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的DNA序列。
PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳（略）
M：DNA Marker （DL2000）; 1:pMD18T載體和EPNP基因; 2: PCR 產(chǎn)物
2.2 重組表達載體pcDNA3.1EPNP的構(gòu)建和酶切鑒定
重組質(zhì)粒用限制酶Hind III和BamHI雙酶切,電泳結(jié)果顯示約716bp處有一特異條帶,證明目的基因已正確插入質(zhì)粒pcDNA3.1,得到了真核表達載體pcDNA3.1ECPNP，。
重組質(zhì)粒HindIII 和BamHI 雙酶切鑒（略）
M：DNA Marker （DL2000）; 1:pcDNA3.1; 2: EPNP基因; 3: 重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP雙酶切
2.3 RTPCR鑒定EPNP基因在MKN45細胞中的穩(wěn)定表達
重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP轉(zhuǎn)染后經(jīng)Ｇ418（500μg/ml）篩選得到Ｇ418抗性細胞克隆,抽提細胞總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 采用特異性擴增EPNP基因的上、下游引物進行PCR反應(yīng),得到了EPNP基因的目的條帶（716bp）,提示Ｇ418抗性細胞克隆中存在ECPNP基因?？召|(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后獲得的Ｇ418抗性細胞克隆經(jīng)RTPCR后無特異性條帶生成，。
圖3 RTPCR 鑒定pcDNA3.1ECPNP轉(zhuǎn)染細胞情況（略）
1: MKN45/pcDNA3.1; 2、3: MKN45/pcDNA3.1EPNP ; M: DNA Marker （DL2000）
2.4 MePdR對轉(zhuǎn)染EPNP細胞的殺傷作用
用不同濃度的MePdR處理轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞，MTT法檢測細胞存活率。處理72h后，許多轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/EPNP細胞脫離了培養(yǎng)皿并且出現(xiàn)“收縮”現(xiàn)象，同時轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1細胞和未轉(zhuǎn)染細胞仍然吸附在培養(yǎng)皿上未出現(xiàn)任何明顯的細胞毒跡象，各種細胞存活率，見表4。很明顯，MePdR并沒有影響親本細胞和轉(zhuǎn)染空載體細胞的存活率，相反，MePdR對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1EPNP細胞有明顯的細胞毒作用。
表4 不同終濃度的MePdR（0～105mol/L）（略）
3 結(jié)論
目前常用的自殺基因體系如:HSVTK體系和CD體系只能抑制DNA的復(fù)制,只能殺傷處于分裂期的腫瘤細胞,而在實體腫瘤中只有一部分腫瘤細胞處于分裂期,故對此類腫瘤,其殺傷力受到一定限制[4，5]。而經(jīng)大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）催化分解藥物前體6甲基嘌呤脫氧核糖核苷（MePdR）產(chǎn)生的MeP不但可以抑制DNA的合成,而且可以抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成,從多個環(huán)節(jié)殺傷腫瘤細胞,不但可以殺傷處于分裂期的瘤細胞,而且可以殺傷靜止的瘤細胞,具有強大的殺傷力。另外，MeP可以穿過脂質(zhì)膜, 不需依賴細胞連接即可到達鄰近細胞,將其殺傷,旁觀者效應(yīng)明顯[6,7]。一個自殺基因體系的旁觀者效應(yīng)越強,其療效就越好。HSVTK體系的毒性產(chǎn)物為磷酸化物。不能透過脂質(zhì)膜,只能通過細胞連接進入緊鄰細胞,故其旁觀者效應(yīng)必須依賴細胞連接[8]。
據(jù)elisa試劑盒報道：
本實驗中構(gòu)建的重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切圖譜與預(yù)期結(jié)果相符,獲得了約716bp大小的目的條帶。目的基因測序結(jié)果與Genbank中登錄的序列一致。因此,本實驗中克隆的EPNP DNA序列是*正確的。我們在實驗中采用特異性擴增EPNP基因的上、下游引物，通過RTPCT反應(yīng)鑒定EPNP基因在轉(zhuǎn)基因MKN45細胞中的表達,證實了具有Ｇ418抗性的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP的MKN45細胞克隆中有EPNP基因的mRNA水平的表達;同時, 用MTT法檢測前體藥MePdR對EPNP高表達細胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)前體藥MePdR對轉(zhuǎn)染EPNP的MKN45細胞有較強的細胞毒作用。說明EPNP確實是藥物敏感基因即自殺基因，也證明了這些細胞中有EPNP基因活性蛋白的表達。本實驗中我們成功獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EPNP基因的MKN45細胞克隆, 為進一步研究PNP的生物學(xué)功能以及在胃癌基因治療中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。