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豬免疫球蛋白M ELISA試劑盒ELISA法
閱讀：1181 發(fā)布時間：2012-12-4 豬免疫球蛋白M ELISA試劑盒ELISA法
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
豬免疫球蛋白M ELISA試劑盒敏感性高，特異性強，重復(fù)性好的實驗診斷試劑盒。且擁有試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀等特點。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。ELISA常用方法：雙抗體夾心法測定。規(guī)格：96T/48T
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和11%。保存條件及有效期：試劑盒保存：2-8℃，有效期：6個月。
測定時一般需經(jīng)過以下步驟：固相包被→加待測樣品→溫育→洗滌+加酶標物→溫育→洗滌→加底物→溫育一加終止液→比色→判定結(jié)果。ELISA操作較繁雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。在操作中應(yīng)注意以下5個方面。
1．隨著病情的進展或由其他因素影響，某些抗體在機體內(nèi)的含量發(fā)生大幅波動，因此有必要對標本進行預(yù)處理，例如對血清標本作適當(dāng)稀釋，或離心分離血脂等。間接法測定中，標本適當(dāng)稀釋還可降低非特異性反應(yīng)。
2．加樣一般使用加液器，在ELISA中一般有4次加樣：加標本、加酶結(jié)合物、加底物和加終止液。加標本時必須每份標本使用一支移液器吸嘴，以免交叉污染。加酶結(jié)合物、底物和終止液時則不需更換吸嘴。
3．在成批手工檢測中，還應(yīng)注意操作時差的影響。加樣及混勻時間的差異，使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時間不一致，對競爭法及定量檢測影響很大，不注意可能會導(dǎo)致錯誤結(jié)果或定量不準。
4．洗滌是ELISA操作過程中決定實驗成敗的一個關(guān)鍵步驟。目的是除去未結(jié)合的免疫反應(yīng)物，終止抗原抗體反應(yīng)，除去標本中與反應(yīng)無關(guān)的成分、游離的酶標物以及反應(yīng)過程中吸附于固相載體上的非特異性物質(zhì)。可用洗板機洗板或手工洗板，前者洗滌質(zhì)量較好，各反應(yīng)孔洗滌效果均一，批內(nèi)、批間差異小，手工洗板應(yīng)注意控制各孔洗滌效果，差異不宜太大。
5．準確判定結(jié)果須使用ELISA測讀儀（酶標儀），比色法判讀可選擇單波長或雙波長，根據(jù)反應(yīng)液顏色的不同選用不同波長的濾光片，以空白孔校零測定反應(yīng)孔的吸光度值（A值）。酶標儀具有良好的重復(fù)性。
ELISA試劑組成
1．抗原 在ELISA中應(yīng)用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。
2．抗體 在ELISA中應(yīng)用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡單，但抗血清成分復(fù)雜，除含針對抗原（多個表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對要低于單抗，且制備周期長，批間差異較大。
3．酶和底物 在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP
（1）HRP：是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。（2）ALP：是一種磷酸酯的水解酶，用做示蹤酶的ALP活性應(yīng)在l 000U／mg以上。
4．固相載體 固相載體是ELISA中用以分離結(jié)合標記物和游離標記物的主要手段，應(yīng)與各種免疫活性物質(zhì)有良好的結(jié)合性能并且不改變其免疫活性。常用的固相載體有聚苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜。
5．包被 將免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合于固相載體上的過程稱為包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等；常用的方法有吸附法、化學(xué)交聯(lián)法及親和素-生物素間接包被法。