熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結果準確，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。在實驗過程中您又該如何準確操作熒光定量PCR儀呢？今天小編就為您列舉一款熒光定量PCR儀的操作步驟：

ABI Prism 7000型定量PCR儀

1、新建文件菜單File → New，Assay選擇Absolute Quantification（實時定量模式），打開一個空白的96孔板文件。
2、探針設置雙擊任意一個孔，打開Well Inspector窗口。該窗口也可以從菜單View → Well Inspector打開。
3、使用軟件，或者探針（Detector）沒有設置好，請點擊Add Detector按鈕，打開Detector 
Manager窗口。該窗口也可以從菜單Tools → Detector Manager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針，點擊按鈕File → 
New，新建探針：設定探針的名稱（建議使用所研究基因符號加標記熒光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等）、報告基團（FAM或者VIC）、淬滅基團（TaqMan探針選TAMRA；MGB探針選None）、顏色（任意）等。設置完成后點擊OK，該探針即出現在探針列表中。重復此過程，設立其他的探針。
4、在Detector Manager窗口，從探針列表中點擊選擇所需探針，按住Ctrl鍵可以選擇多個探針，再點擊Add to Plate 
Document按鈕。較為后點擊Done關閉Detector Manager窗口。此時Well Inspector窗口仍然是打開的。
5、填樣品表在96孔表中選定有樣品的一個或多個孔，在Well Inspector頁面的Sample 
Name欄中填入樣品名稱；在探針列表的Use項下的方框中，打鉤選擇要用的一個或多個探針；在Task欄中選擇樣品類領：陰性對照選NTC；未知樣品選Unknown；標準品選Standard。對于Standard，還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數。注意：只有在這里輸入拷貝數后，軟件才能自動生成標準曲線。建議標準品的濃度在5點以上。建議每個樣品(包括標準品)都按照統(tǒng)計學要求作一定數量的復管。
6、參比熒光如果使用的是ABI公司的定量PCR試劑，如TaqMan Universal PCR Master Mix或者SYBR Green PCR 
Master Mix等，參比熒光（Passive 
Reference）選ROX；如果使用的試劑中不含有參比熒光，請選None。完成后點擊右上角的X按鈕，關閉Well Inspector窗口。
7、循環(huán)參數切換到Instrument頁面，設定及修改PCR熱循環(huán)程序：在ABI公司默認的程序中，50℃

2 
min是UNG酶起作用的步驟，UNG酶可以預防PCR產物（其中以U代替T）對定量PCR的污染；95℃ 10 
min的作用是激活Taq酶，同時滅活UNG酶；40個循環(huán)的95℃ 15 sec和60℃ 1 
min是定量PCR的循環(huán)步驟。7000默認在較為后一步，也就是60℃ 1 
min復性和延伸時收集熒光信號。如果使用ABI公司的定量PCR試劑，上述參數不需要調整，直接運行PCR循環(huán)就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下，如果其中沒有UNG酶，請刪除50℃ 
2 min步驟；如果使用的不是Taq酶而是其他普通的Taq酶，請刪除95℃ 10 min步驟。
8、循環(huán)參數的修改方法刪除：按住Shift鍵并在相應的Stage或Step中點擊，使該步驟被選中變黑，再按Del鍵即可刪除。插入：在需要插入參數的位置點擊，出現粗黑豎線后，分別點擊Add 
Hold、Add Cycle或Add 
Step按鈕添加保溫、循環(huán)或循環(huán)中的一個步驟。修改溫度和時間：拖動鼠標，選中需要修改的溫度或時間數字，輸入新的數值即可。
9、其他設置反應體積：定量PCR的標準反應體積是50 µL；如果想修改的話，建議大于25 µL。融解曲線試驗：在Dissociation 
Protocol選項左邊的方框中打鉤，儀器即在定量PCR循環(huán)完成后繼續(xù)做融解曲線試驗。如果是采用SYBR Green 
I染料方法進行定量研究，建議進行融解曲線試驗，以判定PCR反應特異與否。單峰表示單一的PCR擴增產物，多峰表示PCR擴增有雜帶。注意：只有SYBR 
Green I染料方法才需要進行融解曲線試驗，TaqMan探針和MGB探針法都不需要。9600 
Emulation：選中此項，即可使7000的升降溫速度減慢，與9600和7700一樣，從而可以直接使用在9600、7700型PCR儀上優(yōu)化好的循環(huán)條件，而不需任何修改。
10、啟動擴增點Save按鈕保存文件設置。確認96孔板或全部樣品管在主機內放置妥當后，點擊Start按鈕，開始PCR循環(huán)。屏幕上動態(tài)顯示PCR進程和剩余時間。
11、監(jiān)控進程切換到Results頁面的Amp 
Plot子頁面，可以實時顯示PCR曲線隨著循環(huán)增加而逐步增長的實際情況。如果Detector選FAM或VIC，只顯示對應探針的變化情況；如果選All，則同時顯示所有探針的反應進程。
12、保存結果程序結束后，點Disconnect按鈕，然后File → 
Save保存實驗結果?？梢员４鏋?sds格式，也可以保存為.sdt格式，作為以后同類實驗的模板，節(jié)省軟件設置時間。

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