PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴增的目的和檢測的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類。

基本要素

基本的PCR須具備

1.要被復(fù)制的DNA模板 Template

2.界定復(fù)制范圍兩端的引物Primers.

3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

4.合成的原料（四種脫氧核苷酸）及水。

工作原理

利用升溫使DNA變性，在聚合酶的作用下使單鏈復(fù)制成雙鏈，進(jìn)而達(dá)到基因復(fù)制的目的。

反應(yīng)步驟

分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱（至90~95℃）變性， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下（冷卻至55~60℃）附著于模板DNA兩端。 后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下（加熱至70~75℃）進(jìn)行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。

PCR的早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史，二十世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

實現(xiàn)

1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是改進(jìn)與完善Mullis初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：

①Klenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。

②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNAPolymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

分類

普通的PCR儀

把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，叫傳統(tǒng)的PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運行。主要是做簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。該儀器主要應(yīng)用于科研研究，教學(xué)，醫(yī)學(xué)臨床，檢驗檢疫等機構(gòu)。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常有12種溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。因為被擴增的不同DNA片段，其適退火溫度是不同的，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴增，從而一次性PCR擴增，就可以篩選出表達(dá)量高的適退火溫度，進(jìn)行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間。主要用于科研，教學(xué)機構(gòu)。梯度PCR儀，在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。具有雙槽梯度的不多，領(lǐng)成具備此功能。

原位PCR儀

用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴增儀，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實用價值。

實時熒光定量PCR儀

在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同，只是PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出。把這PCR儀叫做實時熒光定量PCR儀(qPCR儀）