一． PCR的發(fā)展歷史

PCR技術(shù)自問世以來，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領(lǐng)域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用。代 PCR在進(jìn)行擴(kuò)增后通過凝膠電泳進(jìn)行定性分析。

隨著生物分子熒光技術(shù)的發(fā)展，1992年實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應(yīng)運(yùn)而生。qPCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)熒光強(qiáng)度來測定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以Ct值也就成為定量的依據(jù)。基于熒光探針或染料的第二代 PCR 技術(shù)隨后逐漸發(fā)展為檢測核酸目標(biāo)片段的主流分子診斷學(xué)技術(shù)。

在實(shí)時(shí)定量 PCR（qPCR） 過程中，熒光信號隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的積累而增強(qiáng)。qPCR 能夠?qū)崟r(shí)獲得模板擴(kuò)增的熒光值，然后根據(jù)DNA 模板在指數(shù)增長時(shí)期的 Ct 值與標(biāo)準(zhǔn) DNA 的Ct值比較來計(jì)算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應(yīng)系統(tǒng)，非特異性的擴(kuò)增增加了假陽性結(jié)果和背景信號，因此，終無法獲得定量的結(jié)果。

隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代PCR技術(shù)，數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現(xiàn)。digital PCR是一種新的定量PCR，主要是對PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。

圖1. PCR技術(shù)的發(fā)展歷程

二． 數(shù)字微流控（dPCR）的原理

20 世紀(jì)末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

dPCR是一種核酸分子定量技術(shù)。

dPCR一般包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴(kuò)增和熒光定量分析。

在PCR 擴(kuò)增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾萬個(gè)反應(yīng)腔室里反應(yīng)。這樣子相當(dāng)于變相的對靶基因進(jìn)行富集。與此同時(shí)，由于對原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應(yīng)物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。

不同于 qPCR對每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測定的方法，dPCR 技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

圖2. dPCR基本原理

三. dPCR與qPCR的對比

相對于熒光定量PCR（qPCR）而言，dPCR具備以下優(yōu)勢：

1、 靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子：檢測限低至0.001%，原因在于dPCR可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)DNA/RNA的富集；

圖3. dPCR可以實(shí)現(xiàn)痕量核酸的高靈敏檢測

2、 無需標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)曲線），即可對靶分子起始量進(jìn)行定量；

3、 特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測：終點(diǎn)PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴(kuò)增效率，能克服PCR抑制劑的影響，適合動血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等復(fù)雜樣品中DNA的定量；

4、 能夠有效區(qū)分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性，可以用于測定靶基因的相對表達(dá)，基因拷貝數(shù)變異分析等。