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嘔吐毒素ELISA
【概要】
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素(vomitoxin)，主要是由鐮刀菌的某些產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒代謝產(chǎn)物——單端孢霉烯族化合物中的一種。DON 的主要產(chǎn)生菌是禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人和動物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)DON可能與人類食管癌、IgA腎病有關(guān)。DON屬于劇毒或中等毒物，人畜攝入了被DON污染的食物/飼料后，會導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時損害造血系統(tǒng)造成死亡。研究表明，DON可能對免疫系統(tǒng)有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無致癌、致突變作用。谷物及飼料中DON的含量有嚴(yán)格的*。我國谷物中DON 的*為1．0 mg／kg 。因此，有必要對其進(jìn)行有效的監(jiān)控。HPLC或GC-MS用作檢測嘔吐毒素的方法，但是其前處理步驟繁瑣，費(fèi)用昂貴。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒則可經(jīng)濟(jì)、快速地檢測嘔吐毒素。
嘔吐毒素ELISA【適用范圍】
本試劑盒可定性、定量測定大米、小米、小麥等谷物及飼料中的嘔吐毒素。
嘔吐毒素ELISA【試驗原理】
本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預(yù)包被嘔吐毒素抗原，加入樣本/嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的嘔吐毒素抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的嘔吐毒素與預(yù)包被在板孔上的嘔吐毒素抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的嘔吐毒素抗體，未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物嘔吐毒素抗原的含量成負(fù)相關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物嘔吐毒素的含量。
嘔吐毒素ELISA【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：3ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 …………………………………………………… 100%
3-乙?；撗跹└牭毒┐? ……………………………………… 15%
15-O-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 …………………………………… 11%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 36ppb,72ppb
3. 酶標(biāo)物1瓶 …………………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 ……………………………………………12ml
5. 終止液1瓶 ……………………………………………10ml
6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶 ………………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液（20×）1瓶……………………… 40ml
【需要而未提供的設(shè)備】
----微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
----振蕩器
----離心機(jī)
----粉碎機(jī)
----天平：感量0.01g
----微量移液器：單道 20ul～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
【試劑配制】
1. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。
2. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:19體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮樣品提取液+19份去離子水）。
【樣本前處理步驟】
一、大米、小米、面粉等谷物及飼料Ⅰ（稀釋倍數(shù)：50）
1. 取0.1g粉碎好的樣品，加入5ml樣品稀釋液，混勻；
2. 充分振蕩10min；
3. 4000g室溫離心10min；
4. 取100μl上清液體待測。
二、大米、小米、面粉等谷物及飼料Ⅱ（稀釋倍數(shù)：50）
1. 取20g粉碎好的樣品，加入100ml水，混勻；
2. 充分振蕩10min；
3. 4000g室溫離心10min或定性濾紙過濾；
4. 取50μl上清液體，加入450μl樣品稀釋液，混勻；
5. 取100μl上清液體待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。
4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中嘔吐毒素實際含量。
【注意事項】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為2M鹽酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6. 儲存條件：
試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象：
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后，一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應(yīng)時間。
9. 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：3ppb
【樣品zui低檢測限】
谷物、飼料…………………………………………150ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。