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上海寶葉生物科技有限公司 |  資料大小 |
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WORD 文檔 |  資料圖片 |
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1．為了洗脫細菌，將BL21或BLT5615過夜培養(yǎng)的菌液用M9LB稀釋到在600nm處OD值為1。如果使用BLT5615菌株與T7Selectl—1或T7Selectl0—3載體，就必須向菌液中加入IPTG，使其終濃度為10umol/L。
2．將900/21該菌液加到裂解后的細胞中，于室溫下孵育10分鐘。
3．為了測定T7噬菌體的產(chǎn)出量，從步驟2的試管中分別取1ul 1：10稀釋液、1ul原液和10ul原液鋪板，每種鋪3個：分別取1ul 1：10稀釋液、1ul原液和10ul原液加入14ml 聚苯乙烯管中， 同時還加入300rrl的BL21或BLT5615（含IPTG） 菌液，并與4ml熔化的（45～50℃）上層瓊脂混合。將含有噬菌體和細菌的上層瓊脂倒于LB瓊脂（BL21）平板上，或是倒在含50gg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂（BLT5615）平板上。將平板置于37℃孵育1，5～3小時，或室溫下孵育過夜。
4．為了測定每份器官或組織的噬菌體總的產(chǎn)出量，將每個平板上的噬菌斑（pfu）數(shù)目除以鋪板體積（0．1ul、1ul或10ul），然后再乘以1000ul。這樣計算的原因是每份細胞沉淀中添加了1000gl菌液。例如：在腦組織的1ul培養(yǎng)基平板中平均有200pfu的噬菌體，那么在腦組織中噬菌體總產(chǎn)出量為2．0×105pfu/g。對每份器官和組織中的3個平板的計數(shù)取平均值，對數(shù)據(jù)作圖。
5．為了擴增及純化回收的T7噬菌體，將步驟2所剩的噬菌體加到10ml在600nm處OD值為0．5的BL21或BLT5615（加有10mmol/L的IPTG） 菌液中。于37℃搖瓶培養(yǎng)2小時，直到菌液被裂解并變澄清。
6．將菌液倒入30ml的Oak Ridge離心管中，并在Sorvall SS—34或同等的轉子中， 以8000r/min（7670g）離心10分鐘。通過帶0，2um濾頭的注射器將每份上清分別過濾到50m1無菌錐形瓶中，并保存于4℃。T7培養(yǎng)物上清典型的滴定量為107pfu/ul。我們采用T7溶菌液直接進行下面的實驗，而沒有用沉淀法進行進一步的純化。
