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半胱氨酸蛋白酶試劑盒檢測說明
該試劑盒以 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin Conjugate，
HRP-SA）為基礎(chǔ)，可用于檢測細(xì)胞、組織內(nèi)的特異性 caspase-3 抗原。該試劑盒
具有靈敏度高、特異性強、定性定位準(zhǔn)確、背景清晰。在所用的 caspase-3 一抗
與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后，用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合，zui后加入 HRP-SA，形
成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA 復(fù)合物，顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑 ：
試劑 A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑 B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑 C （*分裝）已稀釋的即用型 caspase-3 一抗（2.5ml）
試劑 D （*分裝）生物素化羊抗兔 IgG 1 支
（濃度 1.5 mg/mL，稀釋比為 1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液 20ml
試劑 E HRP-SA 復(fù)合物 1 支（濃度 1 μM，稀釋比 1:50~1:200）100 μL
試劑 F DAB 顯色液 5ml
用戶自備試劑 ：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲烷 1.21g
氯化鈉 7.6g
加蒸餾水 800mL，濃鹽酸調(diào) pH 值至 7.2~7.4，zui后定容至 1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復(fù)液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液）
10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸 0.38g
檸檬酸三鈉 2.45g
加蒸餾水 900mL，濃鹽酸調(diào) pH 值至 6.0，zui后定容至 1000mL
或：0.5M EDTA 修復(fù)液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉 2.45g
加蒸餾水 700mL，用 10mM NaOH 調(diào) pH 值至 8.0，zui后定容至 1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑 10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實驗步驟 （ 建議方案 ）：
石蠟包埋組織切片 3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于 60℃恒溫烤箱中至少烤 1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次
10 min；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇 5min，95%乙醇 2 次（每次 2min），85%
乙醇 2 min；75%乙醇 2min，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×2min；
4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫
度達(dá)到 98~100℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×
2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附 1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，
直接進(jìn)入第 5 步封閉。
5.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 30 min；
6.加一抗：滴加用試劑 C（即用型一抗），37℃濕盒孵育 2 hr 或 4℃；
7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑 D），37℃濕盒中孵育
30 min；
10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑 Tween 20，37℃濕盒孵育封閉 20 min；
12.加 HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑 E（1：50~200，終濃度 5~20 nM），
37℃濕盒中孵育 30 min；
13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應(yīng)用 DAB 溶液（試劑 F）顯色；
15.復(fù)染：自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標(biāo)本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項 ：
1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導(dǎo)致
結(jié)晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使
用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應(yīng)低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用 TBS 充分洗滌，以便洗去組織上殘留的 Tween 20，否則會
影響結(jié)果觀察。
5. 如須復(fù)染細(xì)胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封
片。
附 附 1 1 ：
抗原修復(fù)方法
常用抗原修復(fù)液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修復(fù)液（pH8.0 或
9.0）等等。
一 、 酶消化修復(fù)法
切片脫蠟水化處理，TBS 沖洗，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育
20~30min 后 TBS 沖洗即可。
二 、 微 波抗原修復(fù)法
微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料
切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或繼續(xù)微波 10~15min，取出微波
盒冷卻至室溫后，自來水沖洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異，
須自行調(diào)整。
三 、 直接高壓抗原修復(fù)法
取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上，修復(fù)
液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計時 1.5~2.5min 即可脫離熱源，自
然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。
四 、 隔水式高壓抗原修 復(fù)法
不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸
騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計時
4~8 min 即可關(guān)閉熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用
于較難檢測或核抗原的修復(fù)。