標記抗體與Sulfo-NHS-Biotin的比率-西安瑞禧
一般每個抗體可以標記3-5個，標記時，與抗體的比率受抗體濃度影響，對于10 mg/ml 的抗體溶液來說，應蛋白12倍（摩爾數），對于2 mg/ml 的抗體溶液應20倍，也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
蛋白樣品不得含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物。
一、試劑和器材：
1、 標記反應溶液：0.1M pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）
NaCl 8.77 g ；Na2HPO4·12H2O 32.3g ；NaH2PO4·2H2O 4.5g；加雙蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 調pH 7.2，后定容為 1000mL
2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：稱取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量為587） ，溶解于95 µl 純水中，臨用前配置，不可儲存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，開瓶前平衡室溫。也可以配置200 nmol/L 儲備液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170µl DMSO中，-20℃穩(wěn)定幾個月。
由于NHS-PEG4-Biotin昂貴，而且使用量少，不能保存，配制時，直接將NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以實際稱量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入純水。
3、濾管
⑴、Millipore濾管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，殘留體積200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心10min。
⑵、Millipore濾管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，殘留體積80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心5 min。
⑶、Amicon Ultra -0.5ml離心濾管（Millipore），效果好，的終濃縮物體積：5-15ul。
二、抗體濾處理
標記前需要應用截留分子量為50kDa 的濾柱對抗體進行標記前純化處理(如果不是抗體，一定要按蛋白分子量來確定濾柱截留分子量)，以除去蛋白樣品中可能含有的疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物，防止干擾標記反應。
具體操作步驟：
1、 于濾柱中加入200μl 標記反應溶液，加入500ug 單克隆抗體，混勻。
2、 4℃，6000rpm，離心2min。棄濾液。
3、于濾柱中加入100μl 標記反應溶液，混勻。4℃，Max 14000×g，2min。
4、 重復步驟2 6到7次。
5、 混勻濾柱中的殘留的液體，室溫靜置1min。
6、 將濾柱反轉倒置于一的濾管中，4℃，1000×g，2min，收集濾液。
7、 取50μl PBS于濾柱中混勻，靜置1min。
8、 倒置濾柱，4℃，6000rpm，2min。收集濾液，與步驟6的濾液合并，4℃放置備用。用標記反應溶液調節(jié)抗體濃度到2mg/ml （0.25ml）。
三、標記抗體
1、 計算抗體標記需要用量。
抗體濃度 2 mg/ml時的簡要計算：
1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要26 μL of 10mM NHS-PEG4-Biotin
具體計算方式見附錄一（標記計算）
2、 濾后的濾液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室溫反應1h。
3、 葡聚糖凝膠分離純化(去除游離)：
四、葡聚糖凝膠分離純化標記抗體操作步驟：
（一）、試劑：
1、純化柱處理液 :100 mmol/L Na0H;
2、純化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，每升含0.5g NaN3 ，8g NaCl;
3、樣品洗脫液:同純化柱平衡液;
4、標記抗體保護液（50×）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。
（二）、凝膠過濾：
方法見“凝膠過濾法純化微量標記蛋白”
五、標記抗體的保存方法
將“標記抗體保護液（50×）”加入到標記抗體溶液中，使BSA終濃度為0.1%，4 ℃ 或-20 ℃ 保存。
六、數據記錄：
抗體濃度： mg/ml 加入抗體體積： µl
標記前抗體體積： µl 加入NHS-PEG4-Biotin體積： µl
純化柱規(guī)格： cm × cm 凝膠體積： ml
加入標記抗體體積： µl
洗脫溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白檢測儀顯示出峰后，改為0.5ml/管收集，并記錄數據：
管號 | 1 | 2 | 3 | 4 |
洗脫液體積 |
|
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A280 |
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管號 | 5 | 6 | 7 | 8 |
洗脫液體積 |
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A280 |
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管號 | 9 | 10 | 11 | 12 |
洗脫液體積 |
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A280 |
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附錄：
一、標記計算：
1、不同抗體濃度時，抗體與Sulfo-NHS-Biotin的比率：
Sulfo-NHS-Biotin MW：589
| Sulfo-NHS-Biotin：抗體 |
抗體濃度10-12mg/ml時 | 12 |
抗體濃度4-7mg/ml時 | 16 |
抗體濃度1-3 mg/ml時 | 20 |
抗體濃度0.5mg/ml時 | 50 |
2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：
Sulfo-NHS-Biotin （mg) | PBS（µl) | Sulfo-NHS-Biotin （mg/µl) |
0.56 | 95.1 | 0.00589 |
3、標記計算加入體積計算：
| 計算公式 | 抗體濃度 2 mg/ml時* |
抗體濃度（ mg/ml） |
| 4.5 |
抗體加入量（ml) |
| 0.11 |
抗體加入量（mg) | 抗體濃度×抗體加入量 | 0.495 |
抗體的毫摩爾數（其他蛋白注意分子量） | 抗體加入量/1500000 | 0.0000033 |
需要的活化Biotin量（mmol） | 抗體的毫摩爾數×20 | 0.000066 |
活化Biotin量（mg） | Sulfo-NHS-Biotin量 （毫摩爾）×589 | 0.038874 |
需要10mmol/L 活化Biotin體積（µl） | 活化Biotin量（mg） /活化Biotin濃度（mg/µl) | 6.6 |
西安瑞禧生物可以提供的定制材料包括有：
UV-Tracer Biotin NHS Ester
Biotin-EA -乙二胺
Biotinyl hexylamine
Biotin-PFP 五氟苯酯
Biotin-LC-NHS N-琥珀酰亞氨基6-氨己酸
Biotin-LC; 6-氨基己酸
4-((Biotinoyl)amino)Butyric acid ?；?4-氨基丁酸
Biotin-HZ 酰肼
LC-(+)-Biotin hydrazide CAS:109276-34-8
Biotin-HPDP cas:129179-83-5
D-Biotinol; D-醇 CAS：53906-36-8
BIOTIN DSHSE CAS:142439-92-7
Biotinyl Cystamine -半胱胺 cas:128915-82-2
Biotin-Dadps-azide
Dethiobiotin 533-48-2
Desthiobiotin NHS Ester CAS:80750-24-9
Biotin-ONP (+)--4-硝基苯酯 33755-53-2
Biotin-L-sulfoxid；亞砜 3376-83-8
Biotin-cadaverin trifluoracetate 288259-39-2
N-Biotinyl Glycine;甘氨酸 160390-90-9
D-甲酯;DL-Biotin methyl ester 60562-11-0
Biotin修飾CdTe量子點
化修飾的聚己內酯(PCL/Biotin)
Biotin-PEG-b-Leu
鏈霉親和素化的量子點(streptavidin-QDs)
Prazosin-PEG2000-biotin
(Biotin)表面功能化修飾多壁碳納米管
Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX
PLL-PEG-Biotin
Biotin-PEG-c(RGDyK)
biotin-HWTX-Ⅰ標記蛛神經虎紋捕鳥蛛-Ⅰ
ssDNA-Biotin-SA-AuNPs復合物
標記的透明質酸(HA-biotin
PAH-Biotin修飾半胱氨酸
Biotin-Ebselen小分子探針
偶聯四氨基卟啉
磷?；悸摎ぞ厶?/span>
Chol-Dex-Biotin 偶聯葡聚糖修飾
DOTA-Biotin偶聯大環(huán)配體造影
藻膽蛋白標記Phycobiliprotein-Biotin
藻膽蛋白-鏈霉親和素(Streptavidin-phycobiliprotein)
偶聯物OVA-ZEN-biotin
(Biotin)偶聯的多肽zs6
Biotin-DNA偶聯物
雞卵清白蛋白偶聯(Biotin-OVA)
輔A-(Coenzyme A-biotin)
FITC標記的轉鐵蛋白(Tf-FITC)
(biotin)修飾的ddNTP核苷酸
活化的轉鐵蛋白(Biotin-Tf)
HEMA-biotin-Lys-CD
蛤蚌-偶聯物
姜黃素-偶聯物
多肽CRGD修飾紅膜
偶聯膽甾醇化乙二醇殼聚糖
-葡聚糖聚醛偶聯物(Chol-Dex-CHO)
BIO修飾阿霉素DOX-biotin
修飾BIOTIN-Drud
CY3/CY5/CY5.5-Biotin修飾熒光染料
Biotin alkyne 773888-45-2
Biotin-PEG4-alkyne 1458576-00-5
Biotin-PEG2-C4-alkyne 1011268-28-2
Biotin-PEG4-amide-Alkyne 1006592-45-5
Dde Biotin-PEG4-alkyne 1802908-00-4
PC Biotin-PEG3-alkyne 1869922-24-6
Diazo Biotin-PEG3-alkyne 1884349-58-9
DADPS Biotin Alykne
Biotin-PEG2-azide 1910803-72-3
Biotin-PEG3-azide 875770-34-6
Biotin-PEG4-azide 1309649-57-7
Biotin-PEG2-C6-azide 1011268-29-3
Biotin-PEG4-Picolyl azide 2222687-71-8
Biotin-SS-azide 1620523-64-9
Dde Biotin-PEG4-azide 1802907-93-2
Dde Biotin-PEG4-Picolyl azide 2055048-42-3
Diazo Biotin-PEG3-azide 1339202-33-3
：西安瑞禧生物科技有限公司
以上資料源于西安瑞禧生物科技有限公司
Xi'an ruixi Biological Technology Co;Ltd
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