抗體標記主要有標記、熒光素標記、同位素標記、標記等，還有一些其他的標記方法例如金標記，講述了這些抗體標記的基本原理、操作步驟。

　　一、標記

　　1、辣根過氧化物(HRP)標記
 

　　辣根過氧化物(HRP)標記單抗和多克隆抗體的方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應末了，用試劑穩(wěn)定Schiff氏堿。這里介紹兩種程序。

　　程序一：

　　(1)將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時。

　　(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。

　　(3)加入0.75ml小鼠已處理的，或純化單抗等(15mg/ml)，混勻。

　　(4)稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi);隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套;蓋緊，室溫作用(避光)3小時或4℃過夜。

　　(5)用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘;再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(或4℃過夜)。

　　(6)將交聯(lián)物過Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)層析純化。

　　(7)結合物質(zhì)量鑒定：

　　克分子比值測定

　　量(mg/ml)=OD403×0.4

　　IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62

　　克分子比值(E/P)=量×4/IgG量，一般在1-2之間。結合率=量×體積/抗體，標記率一般為0.3-0.6，即1-2個HRP分子結合在一個抗體分子上，標記率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4時，E/P約為1。

　　標記率=OD403/OD280

　　活性和抗體活性的測定可應用ELISA法、擴散、DAB-H2O2顯色反應測定結合物的活性，抗體活性及效價、特異性。

　　(8)HRP抗體結合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃存放，防止反復凍融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚，否則會影響活性。時凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護劑。

　　程序二：

　　(1)將5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無水乙醇溶液0.1ml，室溫攪拌作用1小時，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。

　　(2)再加1ml 0.06mol/L 過碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色;隨后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，輕攪1小時，中止氧化反應。

　　(3)移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過夜，換三次緩沖液，注意避光。

　　(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫輕攪2-3小時，避光;加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小時或過夜，或換用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml，作用7小時。

　　(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小時，換三次緩沖液。

　　(6)用3000r/min離心30分鐘，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析三次，沉淀用少許PBS溶解，透析或?qū)游龀}，時進一步層析純化。

　　(7)、(8)步驟同程序一。
 

　　2、堿性磷酸(AP)標記

　　堿性磷酸(AP)用于標記抗體，戊二醛一步法，將和單抗混合，再加入適量戊二醛，使和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結合，制備成結合物。該法，但所得產(chǎn)物不均一，抗體活性損失大，標記率低。其程序如下：

　　(1)將5mg AP加入1ml抗體溶液(2mg/ml)中溶解，裝入透析袋，于4℃對0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時，換液三次。

　　(2)加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時，4℃對PBS透析過夜，其間換液三次。

　　(3)換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過夜，換液三次。

　　(4)取出標記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標記物原液。

　　(5)每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

　　3、PAP、APAAP的制備

　　PAP(過氧化物-抗過氧化物橋聯(lián)標技術)、APAAP(堿性磷酸-抗堿性磷酸橋聯(lián)標技術)的制備對于日益使用單抗的化學有意義?，F(xiàn)在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應，只要配以相應的橋抗體，即可便利地應用單抗。因為PAP法和APAAP法不用化學交聯(lián)劑處理和抗體，它們的活性均不受化學因素的影響，提了性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得沉淀物，再加入鹽水，過量的有助于沉淀物的解離反應，調(diào)PH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAP。

　　根據(jù)需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應橋抗體結合后，再與特定單抗組成完整的試劑，這樣，單抗即可一步法用于或檢測試驗等。

　　二、熒光素標記

　　1、異硫氰酸熒光素(FITC)標記

　　FITC標記抗體的原理是在堿性條件下，F(xiàn)ITC 的異硫氰基能與IgG的自由氨基結合，形成IgG與熒光素的結合

物。FITC是的熒光素，其次選用TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)。FITC和TRITC是的雙標記組合。其標記步驟如下：

　　(1)以碳酸鹽緩沖液(PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸餾水1000ml)調(diào)整抗體濃度至10mg/ml。

　　(2)取5ml抗體溶液置于10ml小燒杯中。

　　(3)稱取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內(nèi)，邊加邊輕攪;其后室溫避光作用2小時。

　　(4)將交聯(lián)物經(jīng)Sephadex G25或G50柱層析除去游離的熒光素。

　　(5)FITC的結合物質(zhì)量鑒定

　　IgG量(mg/ml)=(OD280-OD495×0.35)/1.4

　　F/P=2.87×OD495/(OD280-OD495×0.35)，一般說，F(xiàn)ITC對抗體的摩爾比為3：1時適合于組織切片染色，為5-6：1時適合于懸液染色。以標記抗體染色抗原，測定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。

　　(6)標記抗體的保存：宜保存于4℃，加NaN3。

　　2、異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記： 基本與FITC標記相同。

　　三、同位素標記

　　調(diào)的是在使用同位素標記單抗或其他蛋白之前，應掌握同位素操作和防護知識。正常情況下應包括避免物理的接觸和對γ-射線照射的保護，操作和使用同位素標記抗體時，應利用防護裝置，并合理處置含放射性的廢料。

　　1、碘標記

　　用碘標記抗體是一種的標記方法。125I衰變產(chǎn)生的γ和χ射線，很容易被檢測出來，而其60天的半衰期足夠的使用期，且能很地處理放射廢料。的碘標記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入到抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉化成I2，游離I2可與抗體分子中酪氨酸和一些組氨酸發(fā)生鹵化反應，用還原劑和游離酪氨酸終止反應，經(jīng)凝膠過濾將標記的抗體與碘化酪氨酸及還原劑分離開。其主要操作步驟如下：

　　(1)在進行標記之前，先選用截流分子量為20000-50000的凝膠，制備1ml凝膠柱，然后分別用10倍體積的1%BSA/PBS/0.02%疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。

　　(2)加入10ug純化單抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸鈉(PH7.5)的1.5ml指形管內(nèi)。隨后，加入500uCi Na125I混勻。

　　(3)加入25ul配制的2mg/ml氯胺T。室溫放置60秒。再加入50ul氯胺T終止液(含2.4mg/ml偏重亞硫酸鈉，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%環(huán)乙烷酰二甲苯的PBS)。

　　(4)將上述碘標記物上樣在凝膠柱表面，小心放開柱體下口，用1.5ml指形管收集。當?shù)鈽擞浳锶窟M入柱體，加入0.3ml含0.03%疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重復進行，同時用同位素檢測儀測定標記與未標記的單抗。標記抗體大約在至第四管出現(xiàn)。無害化處理柱子和非單抗標記部分。

　　(5)將標記單抗保存于4℃可使用6周時間。

　　2、生物法標記

　　將雜交培養(yǎng)在含有放射性前體的培養(yǎng)基中，隨著抗體分子的、組裝，同位素會標記在抗體分子的初級氨基酸鏈上，本方法不會導致抗體活性的喪失。其主要步驟是：

　　(1)離心收集處于對數(shù)生的雜交，約需2×106個。以預熱37℃不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基洗滌上述。

　　(2)用含2% PBS不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基懸浮雜交至106個/ml，加入35S甲硫氨酸(每次加入100uCi可產(chǎn)生105-106cpm的抗體)。

　　(3)經(jīng)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，離心后，吸出培養(yǎng)上清，分別加入1/20體積的1mol/L Tris(PH8.0)及疊氮鈉至濃度0.02%。該標記抗體可按純化單抗方法進行。

　　四、標記

　　標記反應琥珀酰亞胺酯進行。是與抗體分子的游離賴氨酸等發(fā)生偶聯(lián)反應而完成標記。其主要步驟是：

　　1、用二甲基亞砜配制10mg/ml的N-羥琥珀酰亞胺(應根據(jù)需要選用不同大小和間臂長的化琥珀酰酯)。

　　2、用硼酸鈉緩沖液(0.1mol/L，PH8.0)稀釋單抗溶液至1-3mg/ml。

　　3、每毫克抗體加入25-250ug的酯，混勻后，室溫作用4小時。

　　4、按每250ug酯加入20ul 1mol/L NH4Cl終止反應，室溫放置10分鐘。

　　5、以PBS充分透析除去游離，標記抗體凍存。

　　五、其他標記技術

　　適用于蛋白質(zhì)的其他標記方法也可用于單抗，如金標記、化學發(fā)光標記、SPA標記、鐵蛋白標記等。

　　標記是一種、靈敏度的技術，主要原理是級聯(lián)方法效應。單抗已經(jīng)用于等，主要是利用單抗標記的試劑盒進行的。