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三目熒光顯微鏡標本制作特點和觀察要求
閱讀：1067 發(fā)布時間：2016-6-28
1.三目熒光顯微鏡基本操作步驟
（1）安裝紫外防護罩。
（2）打開高壓汞燈的電源控制箱開關(guān)。
（3）插入擋光板，中斷光路。
（4）預熱5—10分鐘。
（5）將載有樣品的載玻片放到載物臺上。
（6）選擇接物鏡（按照先低倍，后高倍順序）。
（7）旋轉(zhuǎn)分光鏡組件轉(zhuǎn)盤，選擇所需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光時用;“WU”為觀察藍色熒光時用（如DAPl）;“WB”為觀察綠色熒光時用（如FITC）;“WG"為觀察紅色熒光時用（如TRITC）。
（8）使用阻斷濾片（目前多數(shù)阻斷濾片內(nèi)置于熒光顯微鏡）。
（9）通過粗、細螺旋調(diào)整焦距。
（10）打開與顯微鏡連接的計算機，點擊數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件，采集數(shù)碼圖像。
2.三目熒光顯微鏡注意事項
（1）因觀察熒光使用的光源為高壓汞燈，其中發(fā)出的光含紫外光，對人眼有損害作用，故必須安裝紫外防護罩。
（2）為延長汞燈壽命，打開汞燈后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極，一般需要等15分鐘后才能關(guān)閉。
（3）汞燈熄滅后待*冷卻才能重新啟動，否則燈內(nèi)汞蒸氣尚未恢復到液態(tài)，內(nèi)阻極小，再次施加電壓，會引起短路，導致汞燈爆炸。這樣不僅損壞電器，更重要的是汞蒸氣溢出，將導致工作室污染。故關(guān)閉汞燈之后，不能馬上再次打開，必須等待至少30分鐘。
（4）高壓汞燈工作時會散發(fā)大量的熱量，因此，工作環(huán)境溫度不宜太高，必須有良好的散熱條件。
（5）汞燈的使用壽命約200—300小時，在電源控制箱上有時間累計計數(shù)器，使用者要記錄累計小時數(shù)，達到300小時，需更換新燈泡，否則亮度不夠，影響觀察。
3.三目熒光顯微鏡標本制作特點和觀察要求
（1）載玻片：載玻片厚度應在0.8—1.2mm之間，玻片太厚吸收光多，激發(fā)光難以在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。
（2）蓋玻片：蓋玻片厚度應約0.17mm，光潔。為加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這種特制蓋玻片的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂），它可以使熒光順利通過而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標本中的熒光。
（3）標本：組織切片或其他標本不能太厚，一般以5——20pm為宜，切片太厚可使激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察的標本上部不能被激發(fā)。切片折疊或雜質(zhì)過多均可影響熒光的觀察。
（4）封片劑：封片劑必須無自發(fā)熒光、五色透明。加上抗淬滅劑后再用指甲油（實際操作中體會指甲油封片效果很好，可做到薄而均勻）將蓋玻片四周封固，既保持蓋玻片不滑動，又能防止抗淬滅劑蒸發(fā)。在沒有抗淬滅劑的情況下，也可使用含30%甘油的PBS，還可用甘油與0.5mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.0——9.5）等量混合液作封片劑。
（5）鏡頭的清潔：在油鏡使用完畢后，需用擦鏡紙沾上無水乙醇或3：7的醇醚混合液輕輕擦拭。
（6）及時觀察：標本染色后應及時觀察，因時間過長熒光會逐漸減弱。若標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間。