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士鋒生物雙向電泳常見問題
點(diǎn)擊次數(shù)：609 發(fā)布時(shí)間：2013-8-14
1. 重泡脹后的膠可以不用轉(zhuǎn)移到另一個(gè)電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？
一般情況下是可以的。但當(dāng)上樣量特別大時(shí)，可能會(huì)有一部分蛋白質(zhì)沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會(huì)有很多橫向條紋。所以在這種情況下，在重泡脹后，將膠條轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)電泳漕中進(jìn)行電泳。
2. 為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會(huì)減少，暴露出了膠條的背面？
這是因?yàn)?BioRad 的電泳槽有個(gè)蓋子。為了固定電泳槽中的膠條，這個(gè)蓋子上設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的突起，以便壓住膠條。由于虹吸作用，這個(gè)突起會(huì)導(dǎo)引礦物油到相鄰的空電泳槽，從而降低有膠條的電泳槽中的礦物油液面。如果由此把膠條暴露在空氣中，那對(duì)等電聚焦的影響將是毀滅性的。為了防止這個(gè)現(xiàn)象的發(fā)生，可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（ 80 ％滿）的礦物油。
3. 跑*向時(shí)，為什么要設(shè)定一個(gè)電流的zui大值電壓（50 μ A/ 膠）？
電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會(huì)導(dǎo)致膠條的溫度增加。當(dāng)溫度超過 30 攝氏度時(shí)，緩沖液里的尿素就容易解離，產(chǎn)生一些極性分子，從而對(duì)等電聚焦產(chǎn)生影響。
4. 跑*向時(shí)，為什么剛開始的電壓比較低，而后逐漸增高？
剛開始時(shí)，體系內(nèi)的帶電小分子比較多（比如無機(jī)鹽和雙極性分子）。所以在這個(gè)階段，電流主要是由這些小分子的移動(dòng)所產(chǎn)生的。由于這些分子質(zhì)量小，移動(dòng)他們不需要很高的電壓。當(dāng)這些小分子移動(dòng)到他們的目的地時(shí)（無機(jī)鹽移動(dòng)到極性相反的電極；兩性分子移動(dòng)到對(duì)應(yīng)的 pH 條帶），體系內(nèi)的蛋白質(zhì)才開始肩負(fù)起運(yùn)載電流的任務(wù)，逐漸向所對(duì)應(yīng)的 pH 區(qū)域移動(dòng)。
5. 跑*向時(shí)，為什么會(huì)產(chǎn)生一條藍(lán)色的條帶，并逐漸向酸性端移動(dòng)？
藍(lán)色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍(lán)被聚焦所產(chǎn)生的。溴酚藍(lán)也是 pH 指示劑，當(dāng)它移動(dòng)到酸性區(qū)時(shí)（ pH4 ），顏色會(huì)變成黃色。溴酚藍(lán)的這個(gè)移動(dòng)過程大體上發(fā)生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質(zhì)大分子聚焦之前。
6. 跑*向時(shí)，為什么電壓總達(dá)不到預(yù)定值？
當(dāng)上樣量比較大時(shí)或體系內(nèi)鹽分比較多時(shí)，聚焦的電壓有可能達(dá)不到所設(shè)定的數(shù)值。
7. 跑*向時(shí)，在電壓達(dá)到預(yù)定值后，電流為什么會(huì)降低？
當(dāng)上樣量比較少時(shí)，所有蛋白在較短的時(shí)間內(nèi)就移動(dòng)到所對(duì)應(yīng)的 pH 值區(qū)域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恒定的電壓下，電流就會(huì)越來越小。
8. 跑*向時(shí)，為什么在兩個(gè)電極絲附近有氣泡產(chǎn)生？
等電聚焦完成后，所有的蛋白質(zhì)都移動(dòng)到了相應(yīng)的 pI 值區(qū)域，而成為中心分子。這是加在體系上的電壓就開始電解水分子，在陽極產(chǎn)生氧氣，在陰極產(chǎn)生氫氣。
9. 重泡脹緩沖液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？
硫脲的作用是增加蛋白質(zhì)的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質(zhì)的溶解性。當(dāng)?shù)鞍滓苿?dòng)到相應(yīng)的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質(zhì)分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時(shí)的遷移效率，可能會(huì)造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會(huì)鑒定中性蛋白質(zhì)之間的相互作用，防止它們的聚集。
10. 怎樣估計(jì) 2D 膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的分子量和 pI 值？
可以用 BioRad 生產(chǎn)的 2D 膠標(biāo)準(zhǔn)蛋白來校準(zhǔn)。也可以用體系內(nèi)已知蛋白來做比對(duì)。
11. 為什么 2D 膠上的蛋白點(diǎn)有橫的和豎的脫尾？
橫的脫尾可能是： 1 ）一向等電聚焦不*； 2 ）某些蛋白質(zhì)本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的豐度太高。豎的脫尾是因?yàn)榕芏驎r(shí)，蛋白的溶解度不好。
12. 什么成分會(huì)影響 2D 膠的效果？
核酸，鹽，去垢劑等等。
13. 2D 膠的上樣量應(yīng)該在什么范圍？
上樣量和樣品有關(guān)。樣品內(nèi)蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個(gè)點(diǎn)才有足夠的量被檢測(cè)到。一般的全細(xì)胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。
14. 我的蛋白質(zhì)濃度很低，應(yīng)該用什么方法來濃縮？
蛋白質(zhì)的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對(duì)蛋白質(zhì)不會(huì)有修飾和改變，蛋白的種類一般不會(huì)有丟失。它的缺點(diǎn)是總樣品的量可能會(huì)減少（被膜所吸附）。另外超濾對(duì)樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會(huì)堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對(duì)鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點(diǎn)是可能會(huì)有部分種類的蛋白沒有被沉淀下來（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法zui為普遍使用。使用 TCA 法時(shí)，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來的雜質(zhì)。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時(shí)，操作困難。 透析法可以和超濾法聯(lián)用。先把樣品透析到一個(gè)比較干凈的環(huán)境（ 不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質(zhì)，比如碳酸氫氨溶液），然后再進(jìn)行超濾。