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T7 Select噬菌體展示系統(tǒng)分析及其常見(jiàn)問(wèn)題
點(diǎn)擊次數(shù)：788 發(fā)布時(shí)間：2013-8-21
Novagen在T7噬菌體的基礎(chǔ)上研發(fā)出T7Select™ 噬菌體展示系統(tǒng)產(chǎn)品。該系統(tǒng)具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1.復(fù)制所需要的時(shí)間短；2.細(xì)胞質(zhì)中的蛋白可以進(jìn)行組裝；3.產(chǎn)品使用便捷；4.產(chǎn)品的保存簡(jiǎn)單方便；5.克隆產(chǎn)量高；6.T7噬菌體的*優(yōu)點(diǎn)。這些特點(diǎn)都使得T7Select代替了M13系統(tǒng)，成為構(gòu)建文庫(kù)和進(jìn)行親和淘洗一個(gè)更加*的選擇。
該系統(tǒng)以多種產(chǎn)品形式提供，包括T7Select噬菌體克隆試劑盒，包含OrientExpress™ cDNA合成的試劑盒以及T7Select噬菌體克隆系統(tǒng)。
另有12種預(yù)制人正常組織和病理組織來(lái)源的cDNA文庫(kù)提供，這些文庫(kù)都是用T7Select10-3載體構(gòu)建的。
T7噬菌體展示系統(tǒng)與M13系統(tǒng)有什么區(qū)別?
M13和T7噬菌體zui大的區(qū)別就在于成熟病毒從宿主細(xì)胞中釋放的方式不同。M13噬菌體在周質(zhì)中組裝，必須經(jīng)細(xì)胞膜分泌;而T7在細(xì)胞質(zhì)中完成組裝后直接從細(xì)胞裂解出來(lái)。因此，任何抑制分泌過(guò)程的蛋白和多肽都不能在M13系統(tǒng)中展示，或展示效果很差。例如，具有帶電荷氨基酸殘端的疏水蛋白、肽或多肽等，會(huì)因穿膜困難而無(wú)法展示。T7文庫(kù)則不受這種序列限制，而且，一般來(lái)說(shuō)T7展示系統(tǒng)表達(dá)蛋白或多肽的種類(lèi)要比M13這樣的絲狀噬菌體更多。
T7比M13*主要還是表現(xiàn)在易于操作、表達(dá)能力以及親和淘洗富集等方面。T7雖然要求體外包裝但生長(zhǎng)極為迅速。T7噬斑形成僅需3小時(shí)，比M13系統(tǒng)節(jié)約整整1天。M13則在測(cè)序方面比T7更方便。
T7噬菌體極為穩(wěn)定，能在各種嚴(yán)酷的條件下不被破壞，而其它噬菌體常在親和淘洗的過(guò)程中失去活性。因此，在T7系統(tǒng)的結(jié)合/洗脫過(guò)程中，可選用的試劑種類(lèi)較廣泛，親和淘洗后噬菌體仍然保持很高的感染活性。
產(chǎn)品應(yīng)用
許多基于多肽或蛋白功能來(lái)獲得其編碼cDNA的研究多可以選用噬菌體展示技術(shù)，例如：
蛋白相互作用 （例如激素，抗體，受體）
酶分析， 酶抑制
核酸-蛋白相互作用
抗原決定簇作圖
突變分析
常見(jiàn)問(wèn)題與解答
Novagen的人cDNA預(yù)制文庫(kù)是怎么制備的?
Novagen的預(yù)制T7Select cDNA文庫(kù)均以T7Select10-3b制備，材料是經(jīng) Novagen的Straight A’s™ mRNA分離試劑盒兩次純化的mRNA。mRNAzui長(zhǎng)達(dá)8 kb以上，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，用Novagen的OrientExpress™ Random Primer cDNA Kit （帶甲基化dCTP）克隆。原始庫(kù)的重組子為>1 x107 pfu，文庫(kù)的滴度zui低為1 x 1010 pfu。所有文庫(kù)僅經(jīng)一次包裝和擴(kuò)增。
哪一種Novagen的T7噬菌體載體（T7Select1-1，10-3，1-2或415-1）我?
T7Select1-1和T7Select10-3載體適合用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)和PCR克隆 – 能確保產(chǎn)物均為同一閱讀框。作為cDNA載體，由于是定向克隆，所生成的帶正確閱讀框的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物較之非定向克隆方法多1倍。如果采用非定向克隆策略，則獲得按正確閱讀框表達(dá)的多肽或蛋白的幾率會(huì)下降一半，即為克隆總數(shù)的1/6 。
T7Select1-2載體用于從單一cDNA克隆展示蛋白或多肽。因此， cDNA 插入子在T7Select1-2載體上可有3種閱讀框供選擇。
親和淘洗有什么好處?
親和淘洗用于檢測(cè)有蛋白或多肽參與的相互作用非常有效。如果目的序列的配合基被純化和組裝，即可用多肽或蛋白庫(kù)與之反應(yīng)（通常在柱子或96孔板上進(jìn)行），檢測(cè)其結(jié)合情況。“捕獲”的完整噬菌體經(jīng)洗提、擴(kuò)增，再經(jīng)2至3次這樣的富集，即可在很短的時(shí)間內(nèi)一次完成藥物或純化的受體與為數(shù)眾多的多肽或蛋白的結(jié)合分析。采用這種方法進(jìn)行配合基（如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中間體區(qū)域）結(jié)合區(qū)作圖也是可行的。
cDNA在lambda載體表達(dá)與T7Select親和淘洗有什么不同?
確切地說(shuō)，親和淘洗是一種選擇方法，而非僅僅只是一種篩選方法。親和淘洗可以直接發(fā)現(xiàn)和“捕獲”表達(dá)目的多肽或蛋白的噬菌體，這種富集操作較之傳統(tǒng)的lambda噬菌體或質(zhì)粒篩選優(yōu)勢(shì)十分顯著。
為什么T7Select C-端融合很重要?
將目的序列克隆到T7Select載體基因10 的C-端可以使含有終止密碼子的插入序列得以表達(dá)和展示。M13只能進(jìn)行N-端融合，而N-端融合容易發(fā)生移碼錯(cuò)誤。
經(jīng)過(guò)3-4輪親和淘洗富集后，噬菌體的純度能夠達(dá)到多少?
每種目的產(chǎn)物的KD （親和性）都不一樣，用戶可以參考T7Select產(chǎn)品操作手冊(cè)TB178 （“親和淘洗次數(shù)”部分），經(jīng)計(jì)算估計(jì)富集程度。T7Select陽(yáng)性對(duì)照裂解物可作為參考指標(biāo)，但僅供作為目的產(chǎn)物的參考。T7Select陽(yáng)性對(duì)照裂解物可以作為標(biāo)準(zhǔn)參考，但不作為目標(biāo)產(chǎn)物的直接判別依據(jù)。當(dāng) T7Select陽(yáng)性對(duì)照裂解物與沒(méi)有插入片段的噬菌體（T7Select陰性對(duì)照裂解物）以1:106–1:107結(jié)合，同源陽(yáng)性噬菌體經(jīng)過(guò)3或4輪親和淘洗即可在S-蛋白包被的ELISA板上富集。S-蛋白包被的ELISA孔結(jié)合活性約為108–109 pfu，超過(guò)這個(gè)數(shù)值的噬菌體則不能被結(jié)合。
我已經(jīng)做了3-4輪親和淘洗富集，接下來(lái)該怎么辦?
建議在經(jīng)過(guò)3-4輪親和淘洗后對(duì)幾個(gè)噬菌體DNA克隆進(jìn)行測(cè)序。對(duì)目的序列鄰近的序列也進(jìn)行分析，這有助于確定相關(guān)特征信息。陽(yáng)性克隆可以亞克隆到合適的pET載體上表達(dá)、純化及檢測(cè)目的產(chǎn)物。
T7Select系統(tǒng)能表達(dá)足夠的蛋白用于plaque lifts?
低拷貝表達(dá)通常難以用Western分析檢測(cè)到;只有高拷貝表達(dá)的蛋白和多肽可以檢測(cè)。
T7會(huì)侵染其它實(shí)驗(yàn)材料嗎?
T7噬菌體也具有一般是具體的特征，也會(huì)去感染其他的宿主。但是，由于它本身的結(jié)構(gòu)決定，這些宿主必須具有T7基因10殼蛋白的表達(dá)。所以，噬菌體大規(guī)模擴(kuò)撒的危害性就很大程度上減小了。