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士鋒生物二肽的介紹和合成注意事項
點擊次數：1316 發(fā)布時間：2013-8-23
一個氨基酸羧基與另一個氨基酸的氨基失水形成的化合物成為二肽，二肽是zui簡單的多肽。本文總結了二肽的基礎知識以及二肽合成的經驗。
二肽的基礎知識
二肽的概念
二肽（dipeptide ）是二勝肽的zui簡單的肽，由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的酰胺鍵（即-CO-NH-）組成的蛋白質片段或物質。其分子中僅包含一個肽鍵。它們是一大類物質的統(tǒng)稱。
二肽舉例
如由一個含有游離的α-氨基的甘氨酸殘基和一個含有游離的α-羧基的丙氨酸殘基組成的二肽叫甘氨酰丙氨酸。
制備與保存
蛋白質可由酸、堿或酶水解，在水解過程中蛋白質逐步降解成為蛋白胨、多肽、三肽和二肽等越來越小的蛋白質碎片，直到zui后成為氨基酸混合物。
在體內二肽通常能被二肽酶所水解而成為兩個游離氨基酸。在體內腸黏膜細胞上也存在著吸收二肽或三肽的耗能主動運轉體系，故有二肽吸收入細胞先于游離氨基酸之說。
二肽是一種化合物，是天然氨基酸即阿爾法氨基酸（氨基連在連有羧基的碳上）中的氨基于羧基脫水縮合而成的。其中只含一個肽鍵即-CO-NH-?？伤?。
肽大多性質不穩(wěn)定，長期貯存宜防潮，放在4℃以下的地方。
醫(yī)學和商用價值
活性肽，與營養(yǎng)，荷爾蒙、酵素抑制、調節(jié)免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化有非常緊密關系。
合成二肽工作中些許心得
zui近一直在做合成N-Boc-L-His-L-Thr-OMe的實驗，剛讀研一的我來到實驗室，看著凌亂的玻璃儀器，油膩的桌面，而且旋蒸的壓力一點也上不去，看到這些心就涼了一半。剛開始的我不敢向導師提出任何要求，就這樣按著老師給的方案（方案是兩年前師姐用色氨酸和蘇氨酸合成二肽的實驗。）開始了，實驗方案如下：
（1）合成N-Boc-L-Tryptophan色氨酸的合成
在150ml單口瓶中加入2.04g的L-色氨酸，80ml的10%的三乙胺甲醇混合溶液，攪拌溶解。隨后加入叔丁氧碳酸酐4.35g，控制溫度在55℃以下反應30min。反應完后，有機相減壓蒸餾，蒸出大部分的三乙胺甲醇混合溶液。剩余的溶液在冰水浴下用10ml的鹽酸酸化至pH=2,再用乙酸乙酯萃取（60ml×3），合并有機相并用80ml的飽和食鹽水洗滌，無水MgSO4干燥，過濾，蒸除溶劑得到淡黃色的固體。
（2）L-Tyrosine-OMe L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽的合成
向裝有回流冷凝器的150ml單口瓶中加入50ml無水甲醇，冰水浴冷卻下10min內地家乙酰氯6ml，并繼續(xù)攪拌5min。將酪氨酸2.5g一次性加入，然后緩慢升溫至回流，反應3小時。蒸除溶劑得到產品L-Tyrosine-OMe鹽酸鹽備用。
（3）N-Boc-L-Trypophan-L-Tyrosine-OMe
將L-Tyrosine-OMe鹽酸鹽2.31g溶于15mlDMF，加入3ml的三乙胺，攪拌反應15min，加入3.05g的N-Boc-L-Tryptophan色氨酸和二氯甲烷的溶液，滴加5.67gN,N-二環(huán)己基亞酰胺（DCC）溶于10ml二氯甲烷的溶液，反應4小時,過濾。濾液減壓濃縮,加入乙酸乙酯和水,水層以乙酸乙酯提取。將提取液與有機層合并，用10%檸檬酸、飽和食鹽水、飽和碳酸氫鈉依次洗滌。將液體干燥、濃縮,加入石油醚結晶。
當按著實驗做*步時，就遇到了問題,查閱了相關文獻，并且得到蟲子上高手的指點，后來又問了導師，才明白其中的一些原因：師姐論文上的方案改動過，并不是實際方案，當時我感覺好凄涼，悲哀啊，我也明白是導師下令讓改的，目的想必大家都清楚。我想導師也沒想到吧，他這樣做的后果是：吃虧，浪費經費的是他的下下界學生。另外我個人還覺得可能還有其他原因，就是師姐做的色氨酸的方案不適合組氨酸，不過從（BOC）2保護氨基酸氨基的普遍方法來看，原方案確實不妥，而且組氨酸很難溶于三乙胺溶液。所以基本可以否定原方案了。
接下來按著修改過的方案做：
L-His溶于THF:水（1:1）,室溫攪拌5min，加入NaOH溶液是PH為9～10，冰浴至0℃，在1小時～1.5小時內滴加（Boc） 2O，滴加完畢，冰浴下繼續(xù)攪拌2小時，然后緩慢升溫至室溫，反應20小時后，冰浴下調PH為7，減壓蒸除THF,用稀鹽酸調PH為2～3，用乙酸乙酯（60ml×3）萃取，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌，然后用無水MgSO4干燥，過濾，減壓蒸餾的粘稠狀固體。
但產率實在太低，而且反應過程沒找到合適的展開劑，因此無法檢測反應。
因此又制定了方案II
250mL反應器,加入水和二氧六環(huán)各60 mL,再加入L-組氨酸（4. 0 g, 25. 78mmol） ,
用冰浴冷卻至0 ℃,然后加入（Boc）2O （12.376g, 56.71 mmol） ,緩慢加入NaOH溶液，保持容液PH為8～9，自然升至室溫,反應20h. 減壓去除二氧六環(huán),水相用乙迷提取兩次,然后以飽和KHSO4 調節(jié)pH = 1～2,乙酸乙酯萃取三次,飽和NaCl溶液洗滌有機相,無水Na2 SO4 干燥,然后減壓蒸干,得到淡黃色粘稠物。
可是問題又出現(xiàn)在我自身上，由于我把一小打pH試紙放在抽屜中，沒有放入小袋中，而是長期暴露于空氣中，導致失效，可我沒注意到這一點，導致調pH值時調過了頭。結果Boc從氨基上脫落。
在實驗中觀察的現(xiàn)象是長期暴露于空氣中的pH試紙，首先顏色比原色稍白，調pH到4以下，試紙曾現(xiàn)暗灰色，所以4以下就沒法辨別pH值了。
由于在做*步時否定了原定方案，接著自己對原定方案的第二步的可行性產生了懷疑，于是再次求助于小木蟲，得到了蟲子們的熱情幫助，肯定了原實驗方案的可行性，并且讓我明白了其中的反應機理，獲益匪淺。
接著開始了第三步，先是查閱大量文獻（在這次查閱中得知*步中的反應物的量對反應有著顯著的影響，即是否應該把咪唑上的氨也保護的問題。），通過比對文獻以及文獻中與原實驗方案第三步的不同之處，制定了新的方案：
N-Boc-L-His-L-Thr-OMe的合成
稱取N-Boc-L-His10mmol 溶于四氫呋喃（THF），冰水浴冷卻，冰水浴中緩慢加入DCC 10.8mmol,HOBt 10.8mmol ,冰浴冷卻（溶液1） ,磁力攪拌; 稱取L-Thr-OMe 2 mmol 和0.3mL 三乙胺溶于適量的THF溶液中（溶液2） ,將溶液2 和溶液1 混合,并在0℃下攪拌10 h。TLC 顯示原料點消失。停止反應,抽濾。濾液減壓濃縮,溶于乙酸乙酯,分別用質量濃度為飽和碳酸氫鈉、飽和檸檬酸溶液各洗兩次，飽和氯化鈉溶液洗滌一次。取有機相,用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾,石油醚結晶。
做實驗中，1、發(fā)現(xiàn)L-Thr-Me不溶于THF中，加入適量DMF，才溶解掉。
2、減壓蒸餾后發(fā)現(xiàn)大量暗黃色物質。
3、結晶后暗黃色物質與針狀結晶一并析出，于是溶解熱過濾，導致產物大量損失。原因可能是:
a、沒有按蟲友們說的DCC與HOBt的比例應為1.2：0.8加量。
b、用飽和碳酸氫鈉、飽和檸檬酸溶液各洗兩次，飽和氯化鈉溶液的洗滌不夠*。
c、在實驗中發(fā)現(xiàn)乙酰氯滴到醇或水上時，產生爆鳴，由此乙酰氯在常溫滴到醇或水中時，可能會爆炸。
d、還發(fā)現(xiàn)檸檬酸稀釋為吸熱反應，杯底冰涼。
f、還明白了放久了的1，4-二氧六環(huán)放久了旋蒸不會爆炸。（當然旋蒸完要慢慢放氣）。
本次實驗中，雖然產率很低，但作為初次獨立做實驗的我來說，還是學到了很多，而且在實驗室我還領悟到了學做實驗，其實也是在學做人，我學到的東西就是：雖然導師的方案有不妥，但你尊重他，導師不但不會責怪你，還會盡zui大努力支持你，我實驗室欠缺的儀器和損壞的儀器，導師都給買了，雖然比不上那些好學校的實驗室，但比剛到實驗室時有了很大改觀。
肽鍵的合成包括三個步驟即：制備部分的保護氨基酸、使N-保護氨基酸的羧基處于活化狀態(tài)、對保護氨基進行選擇性的脫除（二肽合成中保護基要全部去除）。以上是近幾個月來做二肽合成的個人經驗，分享下供大家交流。