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士鋒BSA封閉液的使用方法大討論
點(diǎn)擊次數(shù)：2363 發(fā)布時(shí)間：2013-9-3
1.可以直接用0.02M的PBS配制
2.不用PBS清洗干凈，直接浸一抗。
B、各位高手，間接法中我想摸索封閉液BSA的*濃度，用抗原包被后，用不同濃度的BSA（0.5%，1%，2%，3%）封閉，其他條件固定，測(cè)得 OD450nm后，可以看出隨著BSA濃度增高，空白值降低，待測(cè)樣品的OD450nm值也降低，，應(yīng)該如何確定BSA的*濃度?
Q1、你的BSA濃度是否太高?zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的BSA，封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA 固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的
Q2、判斷封閉條件，要考慮在此條件下是否能達(dá)到試驗(yàn)要求，即棋盤滴定要滿足：陽(yáng)性樣品OD=0.8、陰性樣品OD<=0.1，而不是看你待測(cè)樣品OD變化趨勢(shì);
過(guò)低封閉濃度勢(shì)必造成本底過(guò)高，但過(guò)高又會(huì)使靈敏度降低，因此只要選擇能夠滿足你試驗(yàn)要求的zui低BSA濃度就可以了。
另外提醒，洗滌一定要*，很重要的。
Q3、包被后封閉前一般要洗滌一遍，以便于洗掉結(jié)合不牢固的包被物，防止在實(shí)驗(yàn)中影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果;封閉后一定不要洗滌，封閉的目的就是要靠蛋白填補(bǔ)未被包被物占領(lǐng)的空間，另外封閉液一般也具有保護(hù)作用。
C、新生牛血清（細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)候加到1640的那一種）可以么，用多大的濃度配比較好啊，是用雙蒸水配嗎??
Q1、5%，TBS配，BSA是牛血清蛋，粉劑，不是牛血清哦
Q2、如果不是用biotin-avidin系統(tǒng)的話，用5%脫脂奶粉做封閉液就可以了，廉價(jià)，效果也很好。
Q3、封閉液一般是用5%的BSA或者是用5%的脫脂奶粉，溶劑一般使用TBST。做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，我一直強(qiáng)調(diào)這樣的一個(gè)原理，那就是在了解原理的基礎(chǔ)之上，我們*可以不拘泥于書本，進(jìn)行創(chuàng)造。就拿這個(gè)封閉液來(lái)講，要是單純的一種封閉效果仍然不好的話，我們*可以兩種合用，我就試過(guò)1%的BSA和5%的脫脂奶粉合用進(jìn)行封閉的事例。所以，搞科學(xué)研究是需要我們進(jìn)行再創(chuàng)造的。
D、BSA交聯(lián)抗原注射到兔子體內(nèi)得到一抗，我們Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗。請(qǐng)問(wèn)，在封閉時(shí)，用什么樣的封閉液比較好呢?是無(wú)蛋白封閉液，還是羊的免疫前血清?
Q1、用5%的脫脂奶粉就可以吧，溶到PBS里，加0.1%的吐溫-20.
E、以前買的是專門的一抗稀釋液，現(xiàn)在用完了，想換BSA液做封閉液用，因?yàn)榕Ｄ烫菀讐牧?，?qǐng)問(wèn)可以長(zhǎng)期保存么么，謝謝誒，5%可以么，哈哈
Q1、5%BSA配完放冰箱就是了，不過(guò)BSA還是有點(diǎn)貴，脫脂奶粉挺好的，現(xiàn)用現(xiàn)配就是了
Q2、BSA確實(shí)有點(diǎn)貴,我們?cè)谂Ｄ讨屑忧Х种?/span>0.2的疊氮鈉,放4度可保存2月左右
Q3、NaN3對(duì)HRP是強(qiáng)烈抑制劑，如果你使用的是HRP標(biāo)記~建議要么更換防腐劑，要么延長(zhǎng)洗膜時(shí)間和次數(shù)。其他防腐劑可以選擇：硫柳汞鈉、極少量的氯仿（1~2ul就可以）
Q4、BSA和牛奶一樣，只要不臭，就可以反復(fù)使用，而且，有的高手提議放的時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，效果反而更好，也許是溶解的更為*的緣故吧。
Q5、都一樣吧，在不加防腐劑的情況下，兩者的保存時(shí)間都不久。我們實(shí)驗(yàn)室是牛奶+疊氮鈉，雖然用的是HRP，但只要洗膜時(shí)間有保證，一般問(wèn)題不大。加了防腐劑的牛奶可以用蠻長(zhǎng)時(shí)間的，一個(gè)月應(yīng)該沒問(wèn)題吧。還有一點(diǎn)就是，有的蛋白用BSA會(huì)更好，有的蛋白則用牛奶會(huì)更好，這是我的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，因?yàn)樵?jīng)用兩種稀釋液做過(guò)同一個(gè)樣品同一個(gè)蛋白的western，結(jié)果證實(shí)牛奶的背景更干凈，特異性更好，BSA的則會(huì)有雜帶。
F、 請(qǐng)免疫熒光高手指點(diǎn),我zui近做了兩次的免疫熒光,均失敗,可基本排除是抗體問(wèn)題,我想問(wèn)問(wèn)熒光高手,其中免疫熒光中的封閉液（我用的是5%BSA）跟我的一抗有關(guān)嗎?封閉液的選擇是否和一抗的稀釋液需相同,非常感謝!
Q1、封閉液對(duì)一抗的結(jié)合影響不大，失敗的原因不應(yīng)該是封閉液的原因。一抗可以用封閉液稀釋。我們做的經(jīng)驗(yàn)看，相對(duì)組化中一抗的濃度，熒光的稀釋比例應(yīng)該大，即假如組化是1：100，熒光可以試1：50。
G、我的包被的蛋白是用bsa偶聯(lián)的二十四個(gè)多肽，我想問(wèn)下我用什么做封閉液才行呢?
Q1、BSA或是酪蛋白的封閉液都行，封閉是為了封閉抗原沒有占據(jù)的空白點(diǎn)，跟你的多肽用何種蛋白偶聯(lián)沒有任何關(guān)系!
H、小弟課題牽涉到ELISA檢測(cè)血清中抗原，在網(wǎng)上看到封閉液的配方又很多種，由于經(jīng)費(fèi)有限，小弟想是否也可以效仿western blot 使用脫脂奶粉作配封閉液，不知各位有沒有這方面的經(jīng)驗(yàn)，或者能介紹一下又有效又實(shí)惠的配方
Q1、脫脂奶粉做封閉液是相當(dāng)?shù)每梢?，另外廉價(jià)的封閉液有BSA，酪蛋白等。都可以用來(lái)做封閉液。
Q2、放在瓶子里溶解，稱量好干粉和其他的鹽后，放到瓶子里使勁搖……讓蛋白和鹽結(jié)晶充分混合，再加水很快就溶了。