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士鋒生物原核表達(dá)之宿主菌株選擇指南
點(diǎn)擊次數(shù)：679 發(fā)布時(shí)間：2013-9-28
在原核蛋白表達(dá)過程中，選擇構(gòu)建一個(gè)合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件,以獲得zui滿意的表達(dá)效果。事實(shí)上，在平時(shí)的實(shí)驗(yàn)中，zui容易被忽視的就是宿主菌的選擇——多數(shù)人會直接選擇自己實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用過的表達(dá)菌株，或者是載體配套的菌株，而不去追究原因——即使表達(dá)結(jié)果不佳，大多在表達(dá)條件和載體上找原因，也不會考究菌株的選擇是否適合。
作為原核表達(dá)的宿主，對外源基因的表達(dá)會產(chǎn)生一定的影響，是勿庸置疑的。每一個(gè)宿主細(xì)胞都像一個(gè)微觀的小工廠，按照細(xì)胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務(wù)”——因?yàn)楹茈y親眼觀察微觀世界中表達(dá)是如何進(jìn)行的，當(dāng)出現(xiàn)問題時(shí)，我們需要經(jīng)驗(yàn)判斷問題所在。宿主細(xì)胞對原核表達(dá)可能會產(chǎn)生哪些影響呢？
知其然還要知其所以然。比如，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。堪稱經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的BL21（DE3）融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。
真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候，真核基因中的一些密碼子對于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta 2系列就是更好的選擇——這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。（已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒）
當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時(shí)，可以選擇K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase （trxB） 和glutathione reductase （gor）兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。（卡那霉素敏感）
Rosetta-gami™ 2則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點(diǎn)，既補(bǔ)充7種稀有密碼子，又能夠促進(jìn)二硫鍵的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）
Origami B是衍生自 lacZY突變的 BL21菌株，這個(gè)突變能根據(jù)IPTG的濃度調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。（四環(huán)素敏感）
在決定試用這些名字古怪的菌株時(shí)，有幾個(gè)小Tips要注意的，一個(gè)是不同菌株有時(shí)已經(jīng)攜帶某個(gè)質(zhì)粒或者已經(jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是否能與之兼容。比如Rosetta 2 已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒，不能再用氯霉素篩選等等。
現(xiàn)象
可能原因
改進(jìn)方案
建議菌株
無蛋白表達(dá)
E. coli 的密碼子偏移性
補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA；將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子
Rosetta 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B
RosettaBlue
出現(xiàn)截短蛋白
包涵體
二硫鍵形成困難
降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽
Origami 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B
表達(dá)過快，表達(dá)量過高
控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化
Tuner
Rosetta-gami B
蛋白無活性
蛋白錯(cuò)誤折疊
降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽
Origami 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B
控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化
Tuner
Rosetta-gami B
細(xì)胞死亡，生長極困難
毒性蛋白
更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制
pLysS 菌株
無克隆生長
過高本底表達(dá)
更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制
pLysS、pLysE 菌株
重組質(zhì)粒和菌株的保存建議
在實(shí)驗(yàn)室里保存重組菌株的時(shí)候，為了挑菌和傳代方便，我們常用LB平板保存在4℃冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達(dá)接種的時(shí)候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達(dá)水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。 我們建議：
1、 長期存放菌株和pET重組子應(yīng)該存在甘油－70℃保種。但是要注意高濃度甘油（> 10%）會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。請盡量保持甘油濃度8％。（15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液1:1就行）
2、重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達(dá)菌株（帶DE3的大腸桿菌）中，請盡量使用帶有recA endA突變的克隆菌株（比如C600，DH）進(jìn)行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會有質(zhì)量不高或者背景的問題。特別是大量抽提。