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士鋒生物GST-標(biāo)記蛋白表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：816 發(fā)布時(shí)間：2013-10-10
材料與試劑
1. IPTG （Sigma）
2. 咪唑 （Sigma）
3. 蛋白酶抑制劑 （Roche）
4. 溶菌酶（Sigma）
5. 谷胱甘肽 瓊脂糖 4B 珠 （Pierce 15160）
6. 谷胱甘肽（Pierce 78259）
7. NP-40 （sigma）
儀器
1. 遠(yuǎn)距離聲波定位器（超聲儀）
步驟
1. 小規(guī)模表達(dá)和純化測(cè)試
1） 接種E. coli到5 ml培養(yǎng)基（ 用于2xYT ）37 °C過(guò)振搖 （12~16 hours），。
2） 第二天，按1:20將其稀釋到新鮮的2xYT培養(yǎng)基。在37 °C 振搖至 OD600 達(dá) 0.6~0.8。按 E.coli 株系和狀態(tài)，一般需要2-3 hrs。
3） 加入0.1 mM IPTG誘導(dǎo)。分別在0 hr，1 hr, 2 hrs, 4 hrs及過(guò)取出 10 ml培養(yǎng)基， 離心后在液氮速凍，保存與-80 °C。
4） 當(dāng)所有的樣品收集好之后，在沉淀中加入1.5 ml 裂解緩沖液 （50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300 mMNaCl, 10 mM 咪唑， 1x 蛋白酶抑制劑， 1 mg/ml 溶菌酶），重懸沉淀。冰上孵育 30 min。
5） 每個(gè)樣品超聲處理15 s，2次。
6） zui大轉(zhuǎn)速4 °C離心30 min，以分離上清和沉淀。1.5 ml 裂解緩沖液重懸沉淀。分別取10 μl上清和重懸液為樣品。
7） 加入10μl谷胱甘肽瓊脂糖4B 珠，4 °C孵育 1 hr并用 200 μl 1 x PBS洗3次。離心后收集上清。
8） 10 μl洗脫緩沖液（20 mM谷胱甘肽， 75 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl）清洗柱子。
9） 每一步取的樣品進(jìn)行合適濃度的 SDS-PAGE，以確定表達(dá)純化的條件和蛋白表達(dá)量。
注：如果有溶解性的問(wèn)題，嘗試降低IPTG濃度和表達(dá)溫度。
2. 大規(guī)模表達(dá)和純化
1） 接種 50 ml E.coli在 37 °C過(guò)培養(yǎng)。
2） 稀釋過(guò)培養(yǎng)物到 1 L， 37 °C振搖直到 OD600=0.4-0.8。
3） 0.1 mM IPTG誘導(dǎo)并在 37 °C培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。
4） 4000× g ， 10 minutes ，4 °C離心收集細(xì)胞。液氮速凍并保存于 -80 °C。
5） 室溫水浴解凍細(xì)胞。置于冰上，用5-7× 沉淀物體積的裂解緩沖液重懸細(xì)胞（參見(jiàn)小規(guī)模測(cè)試的配方，含蛋白酶抑制劑和溶菌酶）。冰上孵育30 min。
6） 個(gè)樣品超聲處理15 s，3次，直到黏度降低。確保裂解物溫度不超過(guò)10 °C。留下 10 μl為樣品。
7） 40,000× g， 4 °C離心30 min，沉淀蛋白。上清和沉淀留取樣品。
8） 根據(jù)小規(guī)模誘導(dǎo)估計(jì)的GST蛋白量和純化情況，以及谷胱甘肽瓊脂糖吸附珠的吸附量（按照說(shuō)明），加入適量珠子。為確保純度，加入的蛋白應(yīng)多于吸附珠的容量。
9） 加入1% NP-40以減少非特異吸附。 4 °C孵育30 min
10） 吸附的漿液用一次性容器收集并收集濾液 。
11） 用20×珠子體積的 PBS洗滌珠子并收集濾液。
12） 加入1×珠子體積的洗脫緩沖液，收集洗脫產(chǎn)物。
13） 重復(fù)上一步驟5次。
14） 洗脫之后，取少量珠子，樣品中加入 SDS上樣緩沖液。
15） 從裂解物，沉淀物，上清，濾液，洗脫緩沖液和吸附珠子取到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。
16） 收集含有帶著GST標(biāo)簽的蛋白經(jīng) PBS 在 4 °C透析至少 1 hr，3次。
17） 液氮速凍并保存于 -80 °C。
配方
1. 2xYT 培養(yǎng)基
細(xì)菌蛋白胨 16g
酵母提取物 5g
NaCl 5g
H2O 800 ml
調(diào)整 pH=7.2
加 H2O到 1L.
高壓滅菌
2. PBS 緩沖液 （pH=7.4） （1 L）
NaCl 8 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.24 g
H2O 800 ml
調(diào)整 pH to 7.4
用重蒸水定容到 1 L
高壓蒸汽滅菌