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士鋒生物脂質(zhì)體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：754 發(fā)布時(shí)間：2013-10-17
外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有三種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法，實(shí)際上其基本原理都是利用不同的方法在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入，但是由于前兩者的效率低且傷害較大，所以現(xiàn)在除了對(duì)于一些特殊細(xì)胞系，一般的轉(zhuǎn)染方法都利用脂質(zhì)體。
利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和其他方法一樣，zui重要的就是防治其毒性，因此脂質(zhì)體與治理的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。
本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法 — 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白）。
【試劑與儀器】
1 、胎牛血清。
2 、雙抗溶液（鏈霉素 100μg+ 青霉素 100 單位）。
3 、DMEM 培養(yǎng)基。
4 、轉(zhuǎn)染試劑（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。
5 、細(xì)胞培養(yǎng)基（ DMEM+10%NCS ）。
6 、PBS 。
7、無(wú)血清培養(yǎng)基。
8 .胰酶（ Trypsin ）。
9 .培養(yǎng)皿，移液管，量筒，恒溫水浴箱，離心機(jī)， 15ml 離心管，微量移液器，熒光顯微鏡和 CCD 。
【操作步驟】
（1）轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
為了得到zui高的轉(zhuǎn)染效率和zui低的非特異性的效果，優(yōu)化條件是必要的，其中包括細(xì)胞的密度以及DNA和脂質(zhì)體的含量。要確保細(xì)胞的匯合率大于90%，調(diào)整DNA和脂質(zhì)體的比值從1:0.5 到1:5來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。
（2）正式轉(zhuǎn)染步驟
1 、轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為 90% 。細(xì)胞鋪板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。
2、對(duì)于每孔細(xì)胞，使用 50μl 無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)基稀釋 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制備。
3、對(duì)于每孔細(xì)胞，使用 50μl DMEM 培養(yǎng)基稀釋 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 試劑。 LIPOFECTAMINE 2000 稀釋后，在 5 分鐘內(nèi)同稀釋的 DNA 混合。保溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低活性。
4、混合稀釋的 DNA （由第 2 步）和稀釋的 LIPOFECTAMINE 2000 （由第 3 步）。在室溫保溫 20 分鐘。復(fù)合物可以在室溫保持 6 小時(shí)穩(wěn)定。注意：溶液可能會(huì)混濁，但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。
5、直接將復(fù)合物加入到每孔中，邊加邊搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。注意：如果在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換為 0.5ml 無(wú)血清培養(yǎng)基。
6、在 37℃ ， 5 %的 CO 2 中孵育 24-48 小時(shí)，無(wú)須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在 4-5 小時(shí)后更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。
7、在細(xì)胞中加入復(fù)合物 24-72 小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。
對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。