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士鋒生物細(xì)胞凋亡的免疫檢測技術(shù)
點擊次數(shù)：616 發(fā)布時間：2013-11-20
一、概述
細(xì)胞凋亡（apoptosis,Apo）是細(xì)胞增殖的反面，探討的是細(xì)胞死亡的方式與機(jī)制。凋亡一詞來源于希臘語。原指花瓣、葉片的脫落。自1972年Kerr提出細(xì)胞凋亡的概念以來，隨著細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)的研究發(fā)展，zui近幾年人們對細(xì)胞凋亡的重大理論意義和實際意義有了更深的理解。細(xì)胞凋亡是指在一定的生理和病理情況下，機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過基因調(diào)控而使細(xì)胞自動消亡的過程。不同類型的細(xì)胞，在發(fā)生凋亡時的動力學(xué)過程也不一致，存在著一定的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的差異，但若干基本變化是大同小異的。其特征為：整個胞體呈濃縮狀，有特異性胞漿大泡，胞質(zhì)、核質(zhì)深染，核碎裂后被細(xì)胞膜包裹而形成凋亡小體（apoptosis body）。它有別于細(xì)胞死亡（necrosis,Nec）。在瓊脂糖凝膠電泳上顯示出特殊的DNA梯狀圖譜。它的出現(xiàn)主要是由于一種鈣-鎂依賴性核酸內(nèi)切酶激活后，裂解染色質(zhì)核小體（nucleosome）之間的連接DNA，將核小體切割成180bp～200bp或其倍數(shù)的片段所致。Apo是不可逆的過程，散在分布于組織中，形成的凋亡小體，除核裂解外，外有膜包繞，內(nèi)有完整的細(xì)胞器，凋亡小體在組織中很快被鄰近組織細(xì)胞吞噬，并在溶酶體中被降解。因此，Apo不引起周圍組織炎癥及損傷。Apo是機(jī)體自己啟動，由細(xì)胞本身主動控制，由基因指導(dǎo)的細(xì)胞自我消亡過程。因此，又稱程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death,PCD）。
光鏡下，Apo的典型形態(tài)學(xué)特征是核染色質(zhì)廣泛凝聚，細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，有凋亡小體存在，細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)如微絨毛等丟失及細(xì)胞表面明顯的迂曲。體內(nèi)細(xì)胞凋亡過程發(fā)展非常迅速，細(xì)胞常在數(shù)小時內(nèi)完成Apo并降解，凋亡細(xì)胞僅出現(xiàn)數(shù)分鐘就消失，故不適宜應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法（普通光學(xué)顯微鏡檢測法、熒光顯微鏡檢測法、凋亡小體的電鏡觀察及凋亡指數(shù)和細(xì)胞活力的定量測定）來檢測。在生物化學(xué)方面，利用電泳技術(shù)證明核體斷片的“DNA梯狀圖譜”作為檢測群體細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個指標(biāo)。經(jīng)過人們多年的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TDT assay or TUNEL reaction）來檢測細(xì)胞凋亡，其靈敏度高，特異性強，能早期顯示未發(fā)生典型變化的凋亡細(xì)胞。它是檢測單個細(xì)胞早期出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的好方法。近幾年，人們又發(fā)現(xiàn)了能更快、更敏感、檢測細(xì)胞數(shù)量更多的并能從更多方面證明凋亡和壞死的流式細(xì)胞分析術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM 包括亞“G1”峰檢測法和末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)）等。本章僅介紹免疫學(xué)檢測方法。
二、elisa法
（一） 原理
細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp～200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段。
（二）材料與試劑
1．采用Boehringer Mannheim公司試劑盒，生物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗
體。
2．過氧化物酶（-POD）標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體
3．鏈霉親合素包被的微孔板
4．DNA－組蛋白復(fù)合物，作為陰性對照。
5．ABTS底物
6．溶解緩沖液
7．溫育緩沖液
8．底物緩沖液
（三）樣品
1．培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物 細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200µl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。
2．培養(yǎng)細(xì)胞的上清液
3．血漿（血清）