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如何用LoWry法（勞里法）測(cè)定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量
點(diǎn)擊次數(shù)：997 發(fā)布時(shí)間：2014-3-4
原理】
LoWry法是雙縮脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的結(jié)合與發(fā)展。其原理是蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理后，堿性銅試劑與蛋白質(zhì)中的肽鍵作用產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，形成銅—蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽。再加入酚試劑后，在堿性條件下，這種被作用的蛋白質(zhì)上的酚類基團(tuán)極不穩(wěn)定，很容易還原酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸(PHosPHoMolyBdATe ＆ PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷鎢藍(lán)和磷鉬藍(lán)的混合物。這種溶液藍(lán)色的深淺與蛋白的含量成正相關(guān)，所以可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。LoWry法除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵的顯色效果更強(qiáng)烈，其顯色效果比單獨(dú)使用酚試劑強(qiáng)3～15倍，約是雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減少了因蛋白質(zhì)種類不同引起的偏差。LoWry法適于微量蛋白的測(cè)定，對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)測(cè)定較為方便。但對(duì)不溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白必須進(jìn)行預(yù)處理(如加入少量的SDS)。
1.雙縮脲法的原理雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在堿性溶液中可與銅離子產(chǎn)生紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中有多個(gè)肽鍵，也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)，所以可用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
雙縮脲反應(yīng)主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性影響較小。且使用試劑價(jià)廉易得，操作簡(jiǎn)便，可測(cè)定的范圍為1～10Mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，能測(cè)出的蛋白質(zhì)含量須在約05Mg以上。雙縮脲法的缺點(diǎn)是靈敏度差、所需樣品量大。干擾此測(cè)定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖液，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生陽性呈色反應(yīng)，銅離子也容易被還原，有時(shí)出現(xiàn)紅色沉淀。
2.福林-酚法的原理 該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應(yīng)：
(1)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物。
(2)此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸—磷鎢酸(ＦolIn試劑)還原，混合物深藍(lán)色(磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物)，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5～100μg蛋白質(zhì)。ＦolIn試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法的缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)的特異性影響，即不同蛋白質(zhì)因絡(luò)氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式。
【儀器與用具】
試管若干；刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管1套(帶橡膠管)；微量滴定管；小燒杯；微量進(jìn)樣器50μl 1支；721分光光度計(jì)；恒溫水浴器；研缽；玻棒；離心機(jī)；離心管。
【試劑】
NA2WO4·2H2O；NA2MoO4·2H2O；85％H3PO4；濃HCl；LI2SO4·H2O；溴水；酚酞指示劑；NA2CO3；NAOH；CuSO4·5H2O；酒石酸鉀鈉；牛血清白蛋白。所用試劑均為化學(xué)純或分析純。