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士鋒生物核酸蛋白轉移電泳及雜交
點擊次數(shù)：548 發(fā)布時間：2014-4-24
一、DNA Southern blot及雜交
本技術可用于基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態(tài)性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離后水解片斷的轉移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。
(一)樣品DNA內切酶水解
限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據(jù)說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的zui適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化緩沖液
10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)
10×bnffer L—低鹽：緩沖液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高鹽：緩沖液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步驟：
(1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入適量H2O總體積為18μL，混勻。
(2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據(jù)廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。
(3)加1～2U限制性內切酶充分混合。
(4)37℃溫育適當時間，時間需先進行預試驗，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達到終濃度為10mmol/L終止反應。
(6)消化后的DNA直接進行瓊脂糖電泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及雜交。
將經電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和后，以毛細管作用在高鹽緩沖液中轉移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。
1、配液：
(1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCl pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/L NaoH調pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。
(4)預雜交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt’S溶液
5mL 5mg/mL魚精DNA
250mL 100%去離子甲酰胺
82.5mL H2O(總體積為500mL)
(5)100×Denhardt’S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(組分V)
加H2O至500ml
2、操作步驟(如圖20-1)：