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士鋒生物SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質
點擊次數(shù)：627 發(fā)布時間：2014-6-5
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N?—tetramethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。
聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：
(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；
(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，在很多溶劑中不溶；
(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；
(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好；
(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g
(6)凝膠孔徑可調節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑；
(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。
凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質分子量密切相關。
表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關系
SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質
聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。
目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理*相同。
SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質
圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖 (A為正面,B為剖面)
(1)樣品膠pH6.7 (2)濃縮膠pH6.7 (3)分離膠pH8.9 (4)電極緩沖液pH8.3
SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質
圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 圖3 凝膠模示意圖
1.樣品槽模板 2.長玻璃板 1.導線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng)
不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。