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純化全長/高純度蛋白方法（Double-tag）
點(diǎn)擊次數(shù)：526 發(fā)布時間：2015-3-10
Protein表達(dá)是一個非常復(fù)雜的過程，因此很難預(yù)測表達(dá)的蛋白是否是可溶性的、包涵體形式還是部分降解的。為了預(yù)防各種可能的困難條件，在重組蛋白上導(dǎo)入兩種Tag可以提供獲得高純度均質(zhì)蛋白的靈活性。
蛋白含有兩種不同親和純化Tag的重要原因：
純化全長的蛋白
獲得zui高純化的蛋白
適合變性或生理條件下純化
優(yōu)化的操作過程，可以直接從培養(yǎng)基中純化蛋白
與Strep-tag?配合zui有效的是6xHistidine-tag，總之推薦一個Tag在蛋白的N-端，另外一個Tag在蛋白的C-端。
純化全長蛋白：
重組的蛋白在表達(dá)時會有部分降解，即使在下游的處理過程中加入蛋白酶抑制劑也無法避免?？扇苄越到獾鞍兹匀粠в屑兓痶ag，在純化時會引起純化蛋白的不純（由于有不同長度片段的蛋白混入）。這種問題可以通過在蛋白的另一端加入第二種Tag來解決。經(jīng)過第二種Tag的純化，即可獲得全長的蛋白。
zui高純度的蛋白：
在生理條件下，Strep-tag純化可以將重組蛋白的純化提升到約99%。由于重組蛋白特性不同，純化的高低也有差異。盡管可以通過更改純化樹脂來解決該問題，但是采用第二種純化Tag是目前zui有限的方法。尤其對于結(jié)晶學(xué)研究、免疫和高通量分析，高純度蛋白的獲得非常重要。
適合變性或生理條件下純化：
很難預(yù)測表達(dá)的重組蛋白是可溶性還是形成包涵體，這由啟動子的強(qiáng)度和蛋白自身的折疊速率所決定。如果蛋白是可溶性的并具有生理功能，Strep-tag是純化的*選擇，因為其可以在生理條件下純化蛋白從而保持蛋白的生物學(xué)活性。如果蛋白以包涵體形式存在，需要加入高濃度的胍鹽或尿素使之變性成為可溶以便親和純化。在此變性條件下，可以借用6xHistidine-tag的金屬鰲合活性分離蛋白。采用Ni-NTA 柱，蛋白還可以重新折疊。如果由必要，可借用Strep-tag在生理條件下純化重新折疊的蛋白。
直接從培養(yǎng)基中純化蛋白：
對于高表達(dá)的載體(如：昆蟲細(xì)胞)，重組蛋白分別到培養(yǎng)基中是經(jīng)常采用的表達(dá)策略。在此情況下，推薦先采用6xHistidine-tag進(jìn)行*步的收集。由于6xHistidine-tag對Ni-NTA matrix具有*的親和能力，通過分批純化，重組蛋白可以收集。作為陽性負(fù)對照，生物素與Strep-tag純化系統(tǒng)不兼容，其通常存在于培養(yǎng)基中，經(jīng)過6xHistidine-tag的收集，生物素可以除去。如果由必要，可以采用Strep-tag作為第二步純化以獲得更高純度的蛋白。