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聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳
點擊次數(shù)：609 發(fā)布時間：2015-5-7
【實驗?zāi)康摹?/strong>
1.掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。
2.學習盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)。
【實驗原理】
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺作為支持物的一種電泳形式。單體-丙烯酰胺和交聯(lián)劑-甲叉雙丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，該聚合反應(yīng)以TEMED作為催化劑，以APS 作為引發(fā)劑。
丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例可決定凝膠網(wǎng)孔的大小，交聯(lián)劑所占比重越大，凝膠的網(wǎng)孔就越小。
利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離主要依據(jù)以下兩個因素：
蛋白質(zhì)所帶靜電荷：在不同的pH條件下蛋白質(zhì)所帶電荷不同。在一定的電場條件下蛋白質(zhì)將向與其所帶電荷相反的電極方向移動，移動速率取決于蛋白質(zhì)表面電荷的數(shù)量，電壓越強或電荷越多則蛋白質(zhì)移動的越遠。其次，蛋白質(zhì)的形狀和大?。旱鞍踪|(zhì)在電泳中所受的阻力主要取決于樣品的大小與凝膠網(wǎng)孔大小之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)分子越小或凝膠網(wǎng)孔越大，所分離樣品所受阻力就愈小，則在電場中的遷移率就越大。在非變性電泳中，天然蛋白質(zhì)的分離就是蛋白質(zhì)所帶電荷、分子大小及分子形狀等因素共同影響，作用的結(jié)果。
遷移率 = 電壓 x 樣品靜電荷/摩擦力
濃縮效應(yīng)可顯著提高聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率，該效應(yīng)可通過引入濃縮膠和不連續(xù)緩沖溶液系統(tǒng)而獲得。濃縮膠處于分離膠的頂部，因此樣品在進入分離膠之前首先要經(jīng)過濃縮膠。它是由較低濃度的丙烯酰胺構(gòu)成，當樣品經(jīng)過濃縮膠時由于膠內(nèi)網(wǎng)孔較分離膠網(wǎng)孔大，樣品的移動速度較快，zui終使樣品“堆積"在濃縮膠和分離膠之間。
另外，濃縮膠還具有比分離膠更低的pH。濃縮膠內(nèi)的緩沖溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,該pH遠低于Tris的pK值(8.1)。分離膠內(nèi)的緩沖溶液是pH 8.9的Tris-HCl，而電泳正負兩極的緩沖溶液均為pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖溶液。在濃縮膠中，小分子并帶有大量負電荷的Cl-在凝膠中的移動速率較快，而電荷較少且分子量較大的甘氨酸的移動速率較慢。由于二者在同一電場中，具有相同的電流，由此形成的電壓梯度導致甘氨酸離子始終跟隨在Cl-的后面，帶有負電荷的蛋白質(zhì)樣品則濃縮在甘氨酸離子和Cl-之間向正極移動。當樣品進入pH 8.9的分離膠時，甘氨酸的解離度增加，在電場中的遷移率高于樣品，蛋白質(zhì)不再夾于兩種離子之間向正極移動，這時的蛋白質(zhì)依靠分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)進行分離。
1. 實驗器材
Bio-Rad公司Mini-ProteanⅡ型電泳儀；電源（電壓200V，電流500mA）；100℃沸水??；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；帶蓋的玻璃或塑料小容器；搖床。
2. 實驗試劑
1.分離膠緩沖溶液 1mol/l HCl 48.0 ml 三羥甲基氨基甲烷 36.3 g 加蒸餾水到100ml 8.9
2.單體交聯(lián)劑 丙烯酰胺 （Acr） 30g 甲叉丙烯酰胺（Bis） 0.8g 加蒸餾水到100ml
3.過硫酸銨 100mg/ml
4.四甲基乙二胺（TEMED）
5.濃縮膠緩沖溶液 1mol/l HCl 48ml 三羥甲基氨基甲烷5.89 g 加蒸餾水到100ml
6.電極緩沖溶液 甘氨酸 28.8g 三羥甲基氨基甲烷6.0 g 加蒸餾水到1000ml, 用前稀釋10倍
【實驗操作】
1.凝膠柱的制備
取l0cm×0.6cm的玻璃管，選擇較平整的一端為底端，量取7.5cm、8cm兩處，畫線；底端管口用小塊膠布封口，插入橡皮墊中，垂直放置于試管架中。用巴斯德滴管吸取分離膠，緩慢貼壁加膠到管內(nèi)7.5cm處，立即加蒸餾水至8cm處。待分離膠凝固后，將膠面上的水分甩掉，殘留的水分用濾紙條吸干，用滴管速加濃縮膠到分離膠面上至8cm處，再小心地加一層覆蓋水。
2.安裝電泳槽
選擇無氣泡、無裂縫、長度合適的小玻璃管，撕掉膠布，安裝到電泳儀上，注意要緊密，以防止上槽緩沖溶液漏液；向下槽注入電極緩沖液，注意用彎頭滴管除去玻璃管下端的氣泡；再向上槽倒入電極緩沖液淹沒小管，同樣用滴管除去氣泡。
3.加樣
用微量注射器取樣品液30μl，沿壁加在濃縮膠面上，注入時要慢，避免激起電極緩沖液。
4.電泳
連接電極，上槽與負極相連，下槽與正極相連；調(diào)節(jié)電流為lmA/管，待示蹤染料進入分離膠時調(diào)節(jié)電流為2mA/管，待示蹤染料接近凝膠管底部約0.5cm處，切斷電源，電泳時間為2小時~3小時。
5.剝膠
取下凝膠管，用局麻針頭注射器吸取一定量的蒸餾水，將針頭插入膠柱-與管壁之間，邊注水邊旋轉(zhuǎn)玻管，直至膠柱與管壁分開，然后用洗耳球輕輕在玻管的一端加壓，使凝膠柱從玻管緩慢滑出，將凝膠柱置于編號的試管內(nèi)，用蒸餾水沖洗幾次。
6.染色
將考馬斯亮藍染色劑倒入放有膠條的小試管中，沒過膠條；60℃水浴保溫40分鐘~50分鐘后取出，用水沖洗2次~3次，觀察結(jié)果。
【實驗結(jié)果】
觀察凝膠條中的蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍染色劑結(jié)合后所形成的藍色復合物，并通過畫圖記錄結(jié)果。
【思考】
⒈聚丙烯酰胺凝膠電泳分離生物大分子的基本原理？
⒉樣品液中加入蔗糖和溴酚藍的目的是什么？