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蛋白質(zhì)組學(xué)同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽方法
點擊次數(shù)：720 發(fā)布時間：2015-6-23
他們提出使用一種試劑，這種試劑能夠使兩種同位素在形式上具有明顯的區(qū)別，即同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽(isotopicallycodedaffinitytag，ICAT)試劑。ICAT試劑的結(jié)構(gòu)包含一個生物素頭部、一個連接部分和一個碘激活的羰基基團(tuán)，這個羰基基團(tuán)能夠特異性地與半胱氨酸側(cè)鏈反應(yīng)。重同位素的形態(tài)與輕同位素的形態(tài)的差別相當(dāng)于在連接區(qū)部分的8個氫原子被8個氘原子取代。
ICAT方法
這種方法的設(shè)計目的是比較一對生物樣品。兩個蛋白質(zhì)樣品(細(xì)胞狀態(tài)I和細(xì)胞狀態(tài)Ⅱ)分別單獨(dú)用d0 ―ICAT和d8―ICAT試劑標(biāo)記，然后混合，并用胰蛋白酶水解。然后將肽混合物送至生物素―親和色譜柱分析。這一步驟通過分離和對含半胱氨酸殘基肽的洗脫來完成對肽混合物的簡化。洗脫步驟與能夠進(jìn)行質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜的儀器偶聯(lián)。一對不同標(biāo)記的肽幾乎在相同的時間洗脫，可以通過兩個距離為8kDa的質(zhì)譜信號識別出來。因為預(yù)計d0 修飾的肽和d8修飾的肽的電離性質(zhì)是相同的，所以在每一個肽上都可以完成相對定量。一旦發(fā)現(xiàn)一對呈現(xiàn)“差別表達(dá)"的肽，就可以明確地進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜來鑒定此肽。
這種技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)比MuDPIT方法得到的數(shù)據(jù)少，能夠直接相對定位二元比較的肽。由于14％的真核蛋白質(zhì)沒有半胱氨酸殘基，這使得這項技術(shù)不適用于這些蛋白質(zhì)。對于基于2D―PAGE的方法難以處理的小的、大的、酸性的、堿性的和疏水的蛋白質(zhì)，這項技術(shù)與MuDPIT方法比基于2D―PAGE的方法有相似的優(yōu)勢。它們也有某些共同的劣勢，如不能獲得*蛋白質(zhì)的信息、處理過程的信息、翻譯后修飾的信息以及混合物中翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的相對豐度的信息。
為了整合這項技術(shù)和2D―PAGE方法的優(yōu)勢，現(xiàn)在開發(fā)了一種新的試劑，這種試劑稱為可裂解的ICAT。此試劑可以與用于2D―PAGE的二元混合物的試劑兼容。這種試劑已由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司投放市場。