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哺乳動(dòng)物細(xì)胞總RNA的分離
點(diǎn)擊次數(shù)：834 發(fā)布時(shí)間：2015-9-6
哺乳動(dòng)物細(xì)胞總ＲＮＡ的分離
細(xì)胞的裂解
提取步驟
注意事項(xiàng)
這一從培養(yǎng)的單層哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離RNA的實(shí)驗(yàn)程序系為Favaloro 等（1980）所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中或從易于分散成單個(gè)細(xì)胞的哺乳動(dòng)物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因?yàn)橛眠@種裂解細(xì)胞的方法（在SDS存在的條件下用蛋白酶k消化）去消化組織速度很慢，導(dǎo)致內(nèi)源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時(shí)間發(fā)揮作用。原方案中（Favaloro等。1980）采用的裂解緩沖液含有0.015 ％（W/V）的Macaloid（硅藻土），用于吸附并滅活RNA酶。盡管現(xiàn)仍有Macaloid出售NL Chemicals）， 但氧釩核糖核苷復(fù)合物和RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑更常用。下述程序的優(yōu)點(diǎn)是速度快，并能同時(shí)處理很多樣品。
一、細(xì)胞的裂解
單層細(xì)胞的裂解
懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解
a．單層細(xì)胞的裂解
a）吸出培養(yǎng)液，以7ml用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的單層細(xì)胞，重復(fù)1次，將平板置于冰上直至所有單層細(xì)胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。
b）直徑為90mm的培養(yǎng)皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個(gè)平板的表面。
RNA提取緩沖注液
0.14mol/L NaCL
1.5mmol/L MgCL2
10mmol/L Tris.CL(pH8.6)
0.5％NP-40
1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）
100單位/ml胎盤rna酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復(fù)合物
c）加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。
蛋白酶消化緩沖液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d）用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)3－4次，剪切DNA。
c）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。
蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。
b．懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解
a）于4℃以2000g離心5分鐘收集細(xì)胞，以10倍體積用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細(xì)胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使其*分散。
b）估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c）加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)3－4次，剪切DNA。
d）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。
二、提取步驟
1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質(zhì)。
2）用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相， 將水相吸至一個(gè)新的離心管內(nèi)，加2.5倍體積用冰預(yù)次序的乙醇，充分混勻， 于0℃放置1小時(shí)。