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如何進(jìn)行植物DNA的提取實驗
點擊次數(shù)：786 發(fā)布時間：2015-9-16
實驗內(nèi)容
采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA,并進(jìn)行純度分析和瓊脂糖凝膠電泳.
目的要求
掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法.
實驗原理
1,原理
核酸是生物有機(jī)體中的重要成分,在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,以核蛋白的形式存在.核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類,在真核細(xì)胞中,前者主要存在于細(xì)胞核中,后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)及核仁里.在制備核酸時,通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使核蛋白被釋放出來.
在濃氯化鈉溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很
小;而在稀氯化鈉溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來.分離得到核蛋白后,需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去,常采用的去除蛋白的方法有3種:①用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液,使其乳化,然后離心除去變性蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間,而DNA溶于上層水相.用兩倍體積95%乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來.如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀,得到的是游離的DNA.②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性,與核酸分離,從而從材料中直接提取出DNA.③用苯酚處理,然后離心分層,DNA或溶于上層水相,或存在于中間殘留物中,蛋白變性后則停留在酚層內(nèi).吸出上面水層,將其注入兩倍體積的95%乙醇溶液中,得到白色纖維狀DNA沉淀.
反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液,就能將蛋白等雜質(zhì)較*地除去,得到較純的DNA制品.為了*除去DNA制品中混雜的RNA,可用RNA酶處理.生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖,在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級沉淀時即被除去.
在DNA提取,制備的過程中,核酸極不穩(wěn)定,許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu):①化學(xué)因素,核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.0—11.0間較穩(wěn)定,pH值在此范圍外就會使核酸變性降解,故制備過程應(yīng)避免過酸過堿.②物理因素,DNA分子鏈很長,是雙螺旋結(jié)構(gòu),既有一定的柔性.又有一定的剛性,故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會令DNA分子斷裂,不利于收集,應(yīng)加以避免.