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士鋒生物PCR技術(shù)：樣品處理與注意事項
點擊次數(shù)：574 發(fā)布時間：2015-9-21
一、樣品處理
DNA是染色體的主要組成部分，是PCR的擴增模板。要進行PCR，研究DNA結(jié)構(gòu)與功能或者用于診斷目的，首先必須從生物體內(nèi)提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp），提取DNA應(yīng)盡量保持DNA完整性和純度，即在提取中盡量避免機械張力引起的DNA分子降解，又要注意雜質(zhì)及蛋白的去除，防止胞內(nèi)酶解DNA。因此，提取DNA的基本過程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解細胞，消化蛋白質(zhì)，使核蛋白解聚及胞內(nèi)DNA酶失活，然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白質(zhì)，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，zui后用乙醇沉淀得到DNA。
理論上PCR對模板DNA純度及完整性要求并不高，細胞經(jīng)過熱變性使DNA釋出就可以作為模板，依賴引物的選擇性進行擴增。這對拷貝數(shù)很多的基因組，確實如此。但當待擴增的拷貝數(shù)甚少而無關(guān)細胞甚多時則擴增就不易成功，其原因是：①非希望的擴增增多，掩蓋了所需擴增的片段，使其數(shù)量減少至不能檢測到的程度。②生物樣品中的雜質(zhì)會抑制pcr反應(yīng)，zui主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應(yīng)液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血紅素也會引起明顯的抑制。對于含血液的樣品，可以用滲透壓溶解紅細胞，離心集取細胞核，洗除血紅蛋白，再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來解決。另一簡單的方法是煮沸之，使釋放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。
現(xiàn)將PCR前處理各種標本的基本方法介紹如下：
1．所需溶液
?。?）PBS 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0
?。?）含表面活性劑及蛋白酶k的PCR緩沖液
50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2
0.1mg/ml明膠，0.45%NP40,0.45%吐溫20
高壓滅菌，冷凍儲存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K（水溶液）至100μl溶液中。
?。?）溶血緩沖液
0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5
5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100