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地衣酚顯色法測(cè)定RNA含量
點(diǎn)擊次數(shù)：5540 發(fā)布時(shí)間：2015-10-8
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?nbsp;
掌握地衣酚顯色法測(cè)定RNA含量的原理和方法
【實(shí)驗(yàn)原理】
RNA與濃鹽酸共熱時(shí)發(fā)生降解，產(chǎn)生的戊糖又可轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛與地衣酚（3,5—二羥基甲苯）反應(yīng)形成綠色復(fù)合物，該產(chǎn)物在670nm處有zui大吸收。當(dāng)RNA濃度為20μg／m1~250μg／m1時(shí)，吸光度與RNA濃度成正比。
【實(shí)驗(yàn)材料】
1.實(shí)驗(yàn)器材
恒溫水浴,721分光光度計(jì)。
2.實(shí)驗(yàn)試劑
（1）RNA標(biāo)準(zhǔn)液：稱取10mgRNA(需先定磷確定其純度)用少量水溶解(若不溶可用2mol／L NaOH溶液調(diào)至pH7.0)，定容至100m1，濃度為100μg／ml。
（2） RNA樣品液：用上述實(shí)驗(yàn)方法提取的RNA樣品
（3） 地衣酚試劑：取0.1g地衣酚溶于100ml濃鹽酸，再加入0.1gFeCl3·6H20。該溶液使用前新鮮配制。
【實(shí)驗(yàn)操作】
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取干燥試管6支，編號(hào)，按表所示加入試劑。
試劑
管號(hào)
0
1
2
3
4
5
RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，ml
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
蒸餾水，ml
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
地衣酚試劑，ml
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
A670
加樣完畢后混勻，于沸水浴中加熱20min，取出置自來(lái)水中冷卻，以零號(hào)管為對(duì)照，670nm處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，RNA濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．樣品測(cè)定
取試管3支，兩支為樣品管，—支為空白管，在樣品管中加入1.0m1樣品液，再加3.0m1地衣酚試劑，混勻，置沸水浴中加熱20min，取出冷卻?？瞻坠懿僮髋c標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中零號(hào)管相同。以空白管調(diào)零點(diǎn)，于670nm處測(cè)吸光度，根據(jù)吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的RNA含量。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論】
1．地衣酚反應(yīng)特異性較差，凡戊糖均有此反應(yīng)，DNA及其他雜質(zhì)也有影響。故一般測(cè)定RNA時(shí)，可先測(cè)定樣品中DNA含量，再算出RNA含量。
2．本法較靈敏。樣品中蛋白質(zhì)含量高時(shí)，應(yīng)先用5%三氯醋酸溶液將蛋白質(zhì)沉淀后再測(cè)定，否則將發(fā)生干擾。
【思考】
配制地衣酚試劑時(shí)，為什么要加FeCl3，6H2O?