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DNA片段從瓊脂糖凝膠中的分離
點擊次數(shù)：606 發(fā)布時間：2015-10-15
一．實驗?zāi)康募氨尘?br>在生物技術(shù)實驗中，PCR反應(yīng)獲得的目的片段，酶切后所得特定的DNA序列， 分子雜交中所制備的探針等，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，目的片段與其它DNA分開， 這就需要有一套方法將目的DNA從凝膠中分離出來，通過處理后得到純化的目的DNA， 以用于以后分子雜交，重組子構(gòu)建，序列分析等.
從凝膠中分離回收DNA的方法
現(xiàn)在常用的技術(shù)有：
電洗脫法
低熔點瓊脂糖凝膠法
DNA濾膜插片法等
其中電洗脫法，經(jīng)濟節(jié)省，操作方便， 對DNA的回收效果好。
低熔點瓊脂糖凝膠法
65oC瓊脂糖凝膠熔點
低熔點瓊脂糖凝膠 37oC 液體
DNA濾膜插片法
High efficient
DNA high quality for microinjection
<5kb fragment
100ng DNA fragment
10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes
0.5 mol/L NaOH 5 minutes
低鹽緩沖液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
高鹽緩沖液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
電洗脫法基本原理
將電泳分離后含目的DNA片段的瓊脂糖切割下來， 裝于透析袋中，繼續(xù)在高電壓下電泳，這時目的DNA會從凝膠中電泳出進入透析袋中， 由于DNA分子量大，不能透過透析袋，從而保留于透析袋中。
取出透析袋中含DNA的溶液， 進一步用酚、氯仿抽提純化。
DNA片段從瓊脂糖凝膠中的分離
三、實驗方法
（一）透析袋的處理：
1．切取適當(dāng)長度適析袋。
2．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分鐘。
3．棄去煮沸液，加無菌水內(nèi)外反復(fù)洗凈透析袋。
（二）電洗脫
1．在長波紫外燈下（300－360nm ）將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中。
2．向透析袋內(nèi)加入２ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡。
3．將透析袋水平放入電泳槽（長度方向與電泳平行）， 加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約６－７mm）。
4．接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠。
5．改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘。
6．從透析袋中吸出緩沖液于1－5ml Eppendorf管中。
7．加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB。
8．在臺式離心機上zui高速2分鐘。
9．吸去上層，正丁醇溶液。
10．重復(fù)7，8，9二次。
11．自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿（２個）抽提２次。
12．上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc ２倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20℃。
13．12000g，4℃下離心10分鐘，得DNA沉淀。
14．棄上清，加入70％乙醇洗滌２次后棄干乙醇。
15．加入50μl TE溶解DNA。
16．取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8％瓊脂糖上， 40伏電泳，3小時。
17．在紫外透射儀上觀察結(jié)果。
18．測定DNA溶液OD260,OD280值。
結(jié)果與分析
1．計算DNA回收效率，判斷DNA純度。
2．記錄電泳結(jié)果
問題與討論：
1．電洗脫過程后，為什么要反向電泳1分鐘？
2．電洗脫后的DNA如何去除EB？