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載體質粒的抽提、純化及檢測
點擊次數(shù)：716 發(fā)布時間：2015-11-19
一、目的:
了解質粒抽提常用的方法和原理；掌握試劑盒制備質粒dna 的法。
二、原理：
（一）質粒DNA 制備三個步驟：
1、細菌培養(yǎng)與質粒擴增
2、菌體收集和溶菌
3、質粒DNA分離
（二）方法介紹：
1、堿變性抽提法（SDS法）:主要是利用染色體DNA和質粒DNA堿性環(huán)境中變性和復性的差異來分離出質粒DNA。染色體DNA 分子量比較大，在堿性環(huán)境中（高pH）變性，雙鏈解拆開，抽提時由于機械剪切力的作用，環(huán)狀斷裂成線狀，當pH 恢復中性時，無法恢復成環(huán)狀，就呈網(wǎng)狀與蛋白質一起通過離心沉淀下來。
質粒DNA 分子量小，在堿性環(huán)境中（高pH），雙鏈解旋，但不拆開,當pH恢復中性時，恢復成環(huán)狀。由于分子量小，所以離心沉淀時，不下沉，保留在上清溶液中。
缺點：SDS 破細胞很厲害，小染色體片段和蛋白質比較多，后處理較困難。
２、酸酚法：主要是利用染色體DNA和質粒DNA 在酸性環(huán)境中變性和復性的差異來分離出質粒DNA。
染色體DNA 分子量比較大，在酸性環(huán)境中（低pH）變性，雙鏈解拆開，抽提時由于機械剪切力的作用，環(huán)狀斷裂成線狀，當pH 恢復中性時，無法恢復成環(huán)狀，就呈網(wǎng)狀與蛋白質一起通過離心沉淀下來。
質粒DNA 分子量小，在酸性環(huán)境中（低pH），雙鏈解旋，但不拆開,當pH恢復中性時，恢復成環(huán)狀。由于分子量小，所以離心沉淀時，不下沉，保留在上清溶液中。
缺點： pH 值太低會降解DNA， pH 的適度難以掌握，稍一偏差，全部DNA 被降解，什么也沒抽到?，F(xiàn)不常用。
3、溴化乙錠-氯化銫（CsCl)梯度離心法:
1）不同的氯化銫濃度和不同的離心時間會成為不同的密度梯度。
2）抽提破細胞后，蛋白質，染色體DNA，質粒DNA,RNA 全部釋放出來，加入溴化乙錠
（EB)，通過EB對不同物質的插入多少而形成不同的密度梯度。EB插入越多,密度越小。離
心后，在離心管中從上到下（密度由小到大）形成的梯度區(qū)域帶如下：
↓
蛋白質（密度zui?。?br>染色體DNA（機械剪切力的作用斷裂成線狀，EB插入較多，密度較?。?br>質粒DNA-線狀（EB 插入較多，密度較小）
質粒DNA-環(huán)狀（EB 插入較少，密度較大）
質粒DNA-超螺旋（EB 插入少，密度大）
RNA（單鏈，EB 插入zui少，密度zui大）
↑
不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl 密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA 與蛋白質區(qū)分開來
優(yōu)點：此法抽提的質粒DNA 高純度。
缺點：1）要求的超速離心機。
2）成本高，氯化銫價格貴。
4.TritonX-100 抽提法：
TritonX-100為非離子極性劑，在溶液中不形成離子，破細胞比較溫和。使用該試劑是為了破細胞時不要太激烈，只形成孔狀破裂，使質粒DNA 釋出（當然還有RNA和一些小片段的染色體DNA 和蛋白質），而不釋出大片段的染色體DNA 。當離心時染色體DNA的大片段與細胞膜的網(wǎng)狀碎片附在一起，與蛋白質一起被離心沉淀，而質粒DNA則留在上清。所以細胞膜破裂的程度是實驗的關鍵。
然后使用苯酚與氯仿來祛除蛋白質。用無水乙醇沉淀回收質DNA。
優(yōu)點：抽提的質粒比較純，較好用, TritonX-100 不影響后續(xù)實驗，可以大量抽提。
缺點：比試劑盒抽提時間要長