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大白鼠肝DNA的提取與鑒定
點擊次數(shù)：804 發(fā)布時間：2015-12-24
一、目的
掌握從動物組織中DNA基本原理和方法，了解利用電泳技術(shù)分離、鑒定核酸的原理和方法。
二、原理
真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于細胞核中，因此制備DNA必須先粉碎組織，裂解細胞膜和核膜，使核蛋白釋放，在除去蛋白質(zhì)、脂類、糖類和RNA等物質(zhì)，得到純化的DNA。在本實驗的提取DNA反應(yīng)體系中，SDS（十二烷基磺酸鈉）破壞細胞膜和核膜，并使蛋白質(zhì)變性，將核蛋白中的DNA與蛋白質(zhì)分開，EDTA及SDS抑制細胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法進一步除去蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀除凈小分子化合物。提取出的DNA制品進一步用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳加以鑒定。
三、材料
（一）儀器
研缽；研缽棒；刻度離心管；普通離心機；小試管；Ep管
（二）試劑
1、生理鹽水
2、裂解緩沖液
3、苯酚：氯仿混合液（1：1）
4、無水乙醇
5、70％乙醇
6、TE緩沖液
7、溴酚藍載樣液
8、溴乙錠溶液
9、TBE緩沖液
四、操作步驟：
1、處死大白鼠，迅速取出大白鼠肝臟，用生理鹽水洗去附著血液，用濾紙吸干血水后稱量0.5g肝實質(zhì)組織放于研缽中。
2、研缽中加入1ml裂解緩沖液、少量石英砂，研磨至勻漿，再加入2ml繼續(xù)研磨至勻漿。
3、取刻度離心管一支，加肝勻漿至1.0ml，再加入等體積苯酚：氯仿混合液抽提，每次抽提以中等大小的力來回振蕩5min，然后離心3000r/min，10min，水相吸入另一干凈的小試管中，抽提重復(fù)3次『注1』。
4、往乘有上水相的小試管中加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕混勻，此時可見有白色絮狀沉淀，此即DNA粗制品。
5、將試管中的上清液倒出，保留沉淀。用70％的乙醇洗滌沉淀2次，洗滌時動作要輕柔，同上法棄上清保留沉淀『注2』。
6、加入0.25mlTE緩沖液溶解沉淀。
7、取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。
8、向Ep管中加入溴酚藍載樣液5ml，混勻后即為鑒定所用樣品。
9、取瓊脂糖0.3g，TBE緩沖液15ml加入錐形瓶中，加熱錐形瓶使瓊脂糖充分熔解后，加入10ml溴乙錠，混勻后將膠液倒入已放置樣孔梳的膠板上。
10、待膠板凝好后拔去樣孔梳，取15ml樣品液加入樣孔槽中。
11、將加好樣品液的膠板放入乘有TBE緩沖液的電泳槽中，樣孔槽位于陰極側(cè)，蓋好電泳槽蓋后通電，調(diào)節(jié)電壓100V電泳40-60min。
12、泳畢，拿出膠板，在紫外光燈下觀察結(jié)果。
『注1』吸水相時不要將界面上的變性蛋白質(zhì)混入，抽提3次后一般有機相和水相界面上的變性蛋白質(zhì)極少，肉眼基本看不見，若變性蛋白質(zhì)仍較多，可增加抽提次數(shù)。實驗中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并燒成鈍口。
『注2』zui后一次棄上清時，盡可能去盡上清。