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RNAi——制備siRNAs的幾種方法
點(diǎn)擊次數(shù)：572 發(fā)布時(shí)間：2016-3-21
越來(lái)越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs)來(lái)抑制特定的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。RNAi的應(yīng)用包括功能基因組學(xué)，藥物靶篩選，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析等等。
目前為止較為常用的5種制備sirnas的方法包括
化學(xué)合成
體外轉(zhuǎn)錄
長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. DICEr, E. coli, RNase III)
siRNA表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs
PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后面兩種方法則依賴能夠表達(dá)siRNAs的DNA載體或者表達(dá)框轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。哪種是的方法，其實(shí)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹＿@里簡(jiǎn)單介紹這5種方法，優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及它們的應(yīng)用。
siRNA的設(shè)計(jì)
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計(jì)siRNA以及siRNA設(shè)計(jì)對(duì)siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來(lái)越多有關(guān)設(shè)計(jì)原則的信息。但這仍然不是的。通常來(lái)說(shuō)，每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3—4對(duì)siRNAs，在后面的實(shí)驗(yàn)中選擇zui有效的那個(gè)。網(wǎng)上有提供免費(fèi)的siRNA設(shè)計(jì)工具。
體外制備
1.化學(xué)合成
盡管化學(xué)合成是zui貴的方法，但是卻是zui方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對(duì)siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出zui有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。
zui適用于：已經(jīng)找到zui有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究
不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素