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熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用
點(diǎn)擊次數(shù)：709 發(fā)布時(shí)間：2016-4-19
熒光定量pcr（也稱TaqMan PCR,以下簡稱FQ-PCR）是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實(shí)現(xiàn)其定量功能的，與變通PCR相比，F(xiàn)Q-PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)。本文擬就該技術(shù)的特點(diǎn)、原理和方法以及應(yīng)用作一簡要敘述。
1 特點(diǎn)
FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應(yīng)用，可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)。如一般PCR產(chǎn)物都需通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色紫外光觀察結(jié)果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測，不僅需要多種儀器，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實(shí)驗(yàn)過程又給污染和假陽性提供了機(jī)會(huì)。而FQ-PCR只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，其后的過程*是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端。實(shí)驗(yàn)一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR擴(kuò)增儀。該儀器具有以下特點(diǎn)：①應(yīng)用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達(dá)研究、病原體檢測及PCR條件的優(yōu)化等。②*的定量原理：采用熒光標(biāo)記探針，經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而達(dá)到定量目的。③工作效率高：內(nèi)置9600型PCR擴(kuò)增儀，電腦控制1～2小時(shí)全自動(dòng)同步完成96個(gè)樣品的擴(kuò)增及定量。④無須凝膠電泳：無須對樣品進(jìn)行稀釋和電泳，只須通過特殊探頭在反應(yīng)管內(nèi)直接檢測。⑤無管道內(nèi)污染：采用*全封閉反應(yīng)管及光電傳導(dǎo)系統(tǒng)，無須顧及污染。⑥結(jié)果重現(xiàn)性好：定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)五個(gè)數(shù)量級(jí)。所以自從此項(xiàng)技術(shù)研制成功以來，受到許多科研工作者的重視并在多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。
2 原理和方法
FQ-PCR的工作原理[1～4]是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基因FAM（6-羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518nm處），靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，熒光發(fā)射峰值在582nm處），探針的3’開端被磷酸化以防止探針在PCR擴(kuò)增過程中被延伸。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測系統(tǒng)檢測到。復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到探針切斷，淬滅作用被解除，熒光信號(hào)釋放出來（見圖）。模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系，因此用該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。實(shí)驗(yàn)儀器一般使用PE公司研制的ABI7100型 pcr擴(kuò)增儀，也可用其它PCR儀。如果用ABI7700型反應(yīng)型反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后，通過電腦分析，可直接給出定量結(jié)果。如果用其他PCR儀，則需要同時(shí)使用熒光探測儀測量反應(yīng)管中的熒光信號(hào)，計(jì)算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光發(fā)射基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度與淬滅基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號(hào)變化量，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結(jié)果。由于熒光探針的引入，顯著提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。探針設(shè)計(jì)一般應(yīng)符合以下條件[2]：①探針長度應(yīng)在20～40個(gè)堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。②GC堿基含量在40%～60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。④探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的
Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。
熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用
圖.TaqMan pcr反應(yīng)模式 （A）聚合反應(yīng)；（B）鏈置換；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，F(xiàn)P：上游引物；RP：下游引物）
圖.TaqMan PCR反應(yīng)模式 （A）聚合反應(yīng)；（B）鏈置換；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，F(xiàn)P：上游引物；RP：下游引物）