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AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：750 發(fā)布時(shí)間：2016-4-25
擴(kuò)增片段長度多態(tài)性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)上發(fā)展起來的DNA 多態(tài)性檢測技術(shù)，具有RFLP技術(shù)高重復(fù)性和RAPD技術(shù)簡便快捷的特點(diǎn)，不需象RFLP分析一樣必須制備探針，且與RAPD標(biāo)記一樣對(duì)基因組多態(tài)性的檢測不需要知道其基因組的序列特征，同時(shí)彌補(bǔ)了RAPD技術(shù)重復(fù)性差的缺陷。同其他以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)相比，AFLP技術(shù)能同時(shí)檢測到大量的位點(diǎn)和多態(tài)性標(biāo)記。此技術(shù)已經(jīng)成功地用于遺傳多樣性研究，種質(zhì)資源鑒定方面的研究，構(gòu)建遺傳圖譜等。
其基本原理是：以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為基礎(chǔ)，結(jié)合了RFLP、RAPD的分子標(biāo)記技術(shù)。把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補(bǔ)的但3-端有幾個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，只有那些與3-端嚴(yán)格配對(duì)的片段才能得到擴(kuò)增)，再在有高分辨力的測序膠上分開這些擴(kuò)增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測之。
一、 實(shí)驗(yàn)材料
采用青稞葉片提取總DNA。
二、 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1.美國貝克曼庫爾特CEQ8000毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，
2.美國貝克曼庫爾特臺(tái)式冷凍離心機(jī)，
3.美國MJ公司PCR儀，
4.安瑪西亞電泳儀等。
三、 實(shí)驗(yàn)試劑
1. 試劑：請(qǐng)使用高質(zhì)量產(chǎn)品，推薦日本東洋坊TOYOBO公司的相關(guān)產(chǎn)品。
DNA提取試劑盒；
EcoRI酶,MseI酶，T4連接酶試劑盒；
Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer；
AFLP引物；
瓊脂糖電泳試劑：瓊脂糖，無毒GeneFinder核酸染料替代傳統(tǒng)EB染料；
超純水（18.2MΩ·cm）
2．其他實(shí)驗(yàn)需要物品
微量移液槍（一套）及相應(yīng)尺寸Tip頭,PCR管,冰浴等。
四、 實(shí)驗(yàn)流程
1、 總DNA提取
使用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA，通過紫外分光光度計(jì)檢測或用標(biāo)準(zhǔn)品跑膠檢測。一般來說，100ng的基因組DNA作為反應(yīng)模板是足夠的。
2、 EcoR1酶消化（20ul體系/樣品）
AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
3、Mse1酶消化（20ul體系/樣品）
AFLP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
5、 預(yù)擴(kuò)增（20ul體系/樣品）
sample 4ul
Primer(Mse1/EcoR1) 1ul
AFLP Core Mix 15ul
* AFLP Core Mix 配方：
ddH2O 13.8ul
MgCl2 1.6ul
dNTPs(2.5mM) 1.6ul
Taq酶(1U/ul) 1ul
10×Buffer 2ul