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RNAi技術(shù)路線選擇及應(yīng)用
點(diǎn)擊次數(shù)：778 發(fā)布時(shí)間：2016-5-9
近年來的研究表明，一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以序列同源互補(bǔ)的mRNA為靶目標(biāo)，降解特定的mRNA。RNAi的發(fā)現(xiàn)具有劃時(shí)代的意義，它不僅深入揭示了細(xì)胞內(nèi)基因沉默的機(jī)制，而且它還是后基因組時(shí)代基因功能分析的有力工具，極大地促進(jìn)了人類揭示生命奧秘的進(jìn)程?，F(xiàn)在越來越多的研究人員開始采用RNAi來研究生物體的基因表達(dá)。RNAi技術(shù)可廣泛應(yīng)用到包括功能基因組學(xué)，藥物靶點(diǎn)篩選，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析，疾病治療等等。
RNAi研究的一般技術(shù)路線是：
RNAi技術(shù)路線選擇及應(yīng)用
由上述的路線可以看出，獲得高純度的sirna產(chǎn)物是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的*步，而轉(zhuǎn)染的效率則是非常關(guān)鍵的因素。
一、siRNA的設(shè)計(jì)
在制備siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，zui有效的siRNAs是21-23個(gè)堿基大小、3‘端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈RNA；而對(duì)非哺乳動(dòng)物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì)顯著削弱基因沉默的效果。
選擇siRNA靶位點(diǎn)：
從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個(gè)AA 3’端相鄰的19個(gè)核苷酸作為候選的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5"和3"端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。
序列同源性分析:
將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。并非所有符合條件的siRNA都一樣有效，其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果，因此對(duì)于一個(gè)目的基因，一般要選擇3-5個(gè)靶位點(diǎn)來設(shè)計(jì)siRNA。
通常來說，每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3—4對(duì)siRNAs，選擇zui有效的進(jìn)行后續(xù)研究。
設(shè)計(jì)陰性對(duì)照：
一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當(dāng)然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。