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引物二聚體的形成于消除
點擊次數(shù)：618 發(fā)布時間：2016-6-12
引物二聚體是引物的3'端間相互錯配擴(kuò)增形成的。引物二聚體的出現(xiàn)是必然的，只是或多或少的問題，電泳時看不到引物二聚體帶也不代表沒有二聚體出現(xiàn)，只是含量低我們 的肉眼看不到而已。提高PCR嚴(yán)謹(jǐn)性(包括提高退火溫度，降低引物濃度等)可大大降低二聚體的濃度。
減少PCR產(chǎn)物中引物二聚體的方法：
1從引物自身 著手，重新設(shè)計引物，這是zui根本解決這一問題的辦法;
2.可能模板有問題;模板濃度過小，適當(dāng)加大模板量;
3.taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可 降低它們的濃度;
4.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻，這時再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引 物二聚體就會消失的；理由：引物可能會發(fā)生發(fā)夾結(jié)構(gòu),自身環(huán)化等結(jié)構(gòu)，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘可使引物變?yōu)閱捂?，以減少二聚體。不過有人認(rèn)為在 PCR儀上95度變性5min也同樣達(dá)到目的，而且成功試過通過延長退火時間也可以消除引物二聚體。
5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可 以增強(qiáng)特異性;
6.PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，zui后加TAq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時間，有人認(rèn)為室溫下有些TAQ酶會將多余的 引物合成為二聚體。
7.增加循環(huán)數(shù);
8.降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度(根據(jù)擴(kuò)增片斷長度 而定，片段長則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些);
9.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mmol/l沒有區(qū)別，則考慮 Buffer等試劑沒有*融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對。
10. 以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100-1000倍，如果間隔較長可以稀釋50-100倍。