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回收.連接.轉(zhuǎn)化.克隆.測(cè)序
點(diǎn)擊次數(shù)：1084 發(fā)布時(shí)間：2016-7-18
目標(biāo)片斷回收后立即與pGEM-T載體做連接反應(yīng)。反應(yīng)體系：2X連接buffer 5μl，回收產(chǎn)物 3μl，T載體 1μl，T4連接酶 1μl，共10μl;混勻，4℃放置16小時(shí)以上
轉(zhuǎn)化:
1、從-70℃冰箱中取40μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,冰上解凍。
2、 加入連接產(chǎn)物1-2μl (含量不超過(guò)50ng,體積不超過(guò)10μl),輕輕彈勻,冰上放置25分鐘后。(38μl ddH2O+20μl KCM+50μl感受態(tài))。
3、42℃水浴中熱擊45秒,熱擊后迅速置于冰上冷卻2分鐘。
4、向管中加入0.6ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、在加有氨芐的瓊脂糖平板上預(yù)加40μl的X-gal和4μl的IPTG，推棒涂勻，放置10min讓其充分吸收
6、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液*被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。
7. 培養(yǎng)12小時(shí)后，挑選圓潤(rùn)的菌落轉(zhuǎn)入另一個(gè)預(yù)加有40μl X-gal和4μl IPTG并劃分不同區(qū)域的平板上，37℃培養(yǎng)8小時(shí)。
陽(yáng)性克隆的鑒定:
做菌落PCR挑選陽(yáng)性克隆:在反應(yīng)管中加入8μl無(wú)菌水，挑選單個(gè)菌落入管中，加10μl礦物油封住液面，95℃反應(yīng)5min。結(jié)束后在每管中加入除模板外的其他反應(yīng)體系，用量與反應(yīng)條件與擴(kuò)增相同。挑選電泳結(jié)果好的測(cè)序。
注意事項(xiàng)
同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照: 對(duì)照組1: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒(méi)有菌落出現(xiàn)。 對(duì)照組2: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。
1.將感受態(tài)細(xì)胞加入要轉(zhuǎn)化的東東(一般原則是轉(zhuǎn)化物體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一)。冰上置半小時(shí)。
2.熱休克：42度，時(shí)間30秒至120秒都可以。一般書上都是90秒。
3.復(fù)蘇：熱休克后加入4倍體積的無(wú)抗生素培養(yǎng)基SOC(如果嫌麻煩，LB也可)，37度搖一小時(shí)。轉(zhuǎn)速低于220轉(zhuǎn)/分鐘。
4.涂板：4000轉(zhuǎn)離心2-3分鐘，多余上清不要，留約200UL將菌液混勻，推平板，直到菌液基本涂干。37度孵箱放12-16小時(shí)。