狠狠色丁香久久综合婷婷亚洲成人福利在线-欧美日韩在线观看免费-国产99久久久久久免费看-国产欧美在线一区二区三区-欧美精品一区二区三区免费观看-国内精品99亚洲免费高清

實(shí)驗(yàn)原理：核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA僅有1%～5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對(duì)于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的Dmem培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L

注意：對(duì)受體細(xì)胞先做預(yù)試驗(yàn)，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的zui低濃度。

2、操作步驟[方法一]：

(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受體細(xì)胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動(dòng)物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等，該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞占50～70%瓶底面積時(shí)，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細(xì)胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時(shí)向供體細(xì)胞DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。

(4)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期已占瓶底50～70%的受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml(25ml培養(yǎng)瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO2培養(yǎng)24h或更長(zhǎng)，使細(xì)胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。

④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時(shí)設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞。

⑥培養(yǎng)大約3～5天，對(duì)照細(xì)胞大部分死亡，這時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。

⑦2周后對(duì)照細(xì)胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見有抗藥性的細(xì)胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，并做進(jìn)一步鑒定。

本實(shí)驗(yàn)要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，這樣可使受體細(xì)胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”，也可測(cè)出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標(biāo)記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞建立細(xì)胞株。若以獲取“轉(zhuǎn)化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細(xì)胞中提取的基因組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞即可，其方法如下：

3、基因組DNA轉(zhuǎn)染[方法二]：

(1)配制磷酸轉(zhuǎn)染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用時(shí)現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存?zhèn)溆?/p>

加溫水至 1000mL

(2)按前面介紹的方法提取癌細(xì)胞基因組DNA。

(3)取供體基因組DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。

(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。

(5)加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結(jié))，置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁蘭色時(shí)，即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 (6)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)，更換培養(yǎng)液(5ml/瓶)1次。

(7)轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小時(shí)。

(8)培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時(shí)血清用量降至5%，培養(yǎng)2～3周。

(9)檢測(cè)：逐日觀察，待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后，克隆分離，擴(kuò)大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。

脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法

脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。

用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做：*，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1～5μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間(2～24小時(shí))。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24小時(shí)為宜。

細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

1、操作步驟[方法一]：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃CO2培養(yǎng)至40%～60%匯合時(shí)(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。

(2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。

(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

(4)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5)其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：

(1)以5×105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到50～60%板底面積。

(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3)棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3～5小時(shí)。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時(shí)，

(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24～48小時(shí)。

(6)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1)接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2)、(3)步驟。

(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。

(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。

DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30分鐘-1.5小時(shí))，又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí))。

方法如下：

(1)接種鼠L成纖維細(xì)胞濃度為5×105CO2/孔/皿生長(zhǎng)2～3天，當(dāng)達(dá)50%板底面積可用。

(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒DNA，空氣干燥后溶于40μL的TE中，或取供體DNA。

(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長(zhǎng)因子血清的DMEM洗板(皿)。

(4)在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細(xì)胞中，使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)直到顯示均勻一致的紅色，培養(yǎng)4小時(shí)。

(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培養(yǎng)液(10%血清的DMEM)。

(6)培養(yǎng)細(xì)胞，在適當(dāng)時(shí)間分析細(xì)胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，方法同前。