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目的基因克隆的篩選與鑒定
點擊次數(shù)：2517 發(fā)布時間：2017-3-8
目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導入細胞的效率都不是的，因而zui后生長繁殖出來的細胞并不同都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細胞只接受一個重組DNA分子。zui后培養(yǎng)出來的細胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant）。將目的重組體篩選出來就等于獲得了目的序列的克隆，所以篩選(dcreening)是基因克隆的重要步驟。在構(gòu)建載體，選擇宿主細胞、設計分子克隆方案時都必須仔細考慮篩選的問題。以下就常用技術(shù)的基本原理加以介紹。
一、根據(jù)重組載體的標志作篩選
zui常見的載體攜帶的標志是抗藥性標志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四環(huán)素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。當培養(yǎng)基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個抗藥性標志就會消失。例如質(zhì)粒pBR322含有anpr、和terr兩個抗藥基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，讓細菌放在含氨芐青霉素或四環(huán)素培養(yǎng)基中，凡未接受質(zhì)粒dna的細胞都不能生長；凡在含氨芐青霉素和四環(huán)素中都能生長的細菌是含有質(zhì)粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生長、而在四環(huán)素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質(zhì)粒。
載體含有l(wèi)acZ"的藍白篩選法，近年更被廣泛應用。例如將目的序列插入前面述及的質(zhì)粒pUC19的多克隆位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，凡能生長并呈白色的菌落，其細菌中就很可能含有插入目的序列的重組質(zhì)粒，這樣就很容易獲得目的序列的克隆。
根據(jù)重組載體的標志來篩選，可以篩選去大量的非目的重組體，但還只是粗篩，例如細菌可能發(fā)生變異而引起抗藥性的改變，卻并不代表目的序列的插入，所以需要做進一步細致的篩選。
二、核酸雜交法
利用標記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細胞的DNA進行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉(zhuǎn)化后生長的菌落復印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標記，結(jié)合了放射性核酸探針的菌落集團可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。
三、PCR法
PCR技術(shù)的出現(xiàn)給克隆的篩選增加了一個新手段。如果已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設計合成一對引物，以轉(zhuǎn)化細胞所得的DNA為模板進行擴增，若能得到預期長度的PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化細胞就可能含有目的的序列。