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培養(yǎng)細胞的冷凍保存與復蘇
點擊次數(shù)：1168 發(fā)布時間：2017-3-20
冷凍保存與復蘇原理
在低于-70℃的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏?，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當以適當?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴椭脸貢r，其內(nèi)部的生化反應可恢復正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復蘇就是以一定的復溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。
水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。
這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而導致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏，在復溫時，大量水分會因此進入細胞內(nèi)，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當溫度進一步下降，細胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復到常溫，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細胞經(jīng)復蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。
¨冷凍速率
冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化：當細胞被冷至-5℃時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當被冷至-5～-15℃之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學能。其結(jié)果是，細胞內(nèi)水分子為了和細胞外水分子保持化學能的平衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯瑒t細胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。
不同的冷凍速度既然能使細胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細胞產(chǎn)生不同的損傷。當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當冷凍速度過快時，細胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細胞膜及細胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是zui為理想的冷凍方法。細胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時間暴露而受損。
不同細胞的zui適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞的zui適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min和200℃/min。細胞與細胞之間的zui適冷凍速率可在1.6℃～300℃/min，故對一種細胞進行冷凍保存之前，首先需要測定其zui適冷凍速率，以保證獲得zui高的冷凍存活率。