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mRNA差別顯示技術[DDRT
點擊次數：900 發(fā)布時間：2017-8-2
隨著PCR技術的發(fā)展，人們在此基礎上建立起了一系列基于基因分離的新技術新方法。如mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR）、以及進一步改進的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除雜交（SSH）和交互扣除RNA差別顯示技術（RSDD）。
差別顯示ＰＣＲ是根據絕大多數真核細胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人Liang P和Pardee A根據Poly A序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5’-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行pcr擴增能產生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。
差別顯示技術自1992年建立后，一直在不斷進行著改進。如在1994年，Ito等對3′端錨定引物的設計由固定兩個堿基變?yōu)橐粋€堿基固定的引物，這就使原來12種引物減至3種即可(5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ)，這樣做減少了每個mRNA樣品對逆轉錄反應種類的需要，并且把由于簡并性引起的某些ＲＮＡ的代表性差和RNA數量過多現象降低到zui低程度；在隨后的兩年中，研究人員有在3′端引物和5′隨機引物末端分別加上了限制性內切酶識別位點(如Hind III酶切位點)，使得5′端引物條數改為8條，長度為13bp，而3′端引物則由18個堿基組成。這樣形成的24種引物對，經計算機同源性分析表明同樣能覆蓋全部mRNA，使實驗簡化，同時由于引物變長，使cDNA擴增更為有效。有的實驗室采用把Bakman公司的kit，其引物5′端為26bp，3′端為31bp，并加上了T3和T7兩端的測序引物，由儀器切割差異條帶后，再次擴增，并通過熒光標記，用計算機統(tǒng)計出結果。此外，許多學者針對該技術在****作中假陽性高等問題，還從設計對照、提取胞質RNA、更換放射性標記物以及改變PCR反應條件等等方面提出了相應解決方案，以求這一技術得到進一步完善。
DD-PCR與示差篩選、扣除雜交相比,具有很多優(yōu)點:
1)速度快,較易操作;
2)由于pcr擴增技術的應用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高;
3)可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達的差異。
盡管差別顯示技術有以上諸多方面的優(yōu)點,但在實際操作中仍存在一些問題,主要表現在:
1)出現差別條帶太多,假陽性率高達70%左右,重復性差,且對高拷貝數的mRNA具很強的傾向性;
2)擴增條帶分子長度較短,一般在110～450bp之間。