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            拓赫機電科技(上海)有限公司

            ibiPoreSiN玻璃膜上人類內(nèi)皮細胞在剪切力環(huán)境下的培養(yǎng)方案

            時間:2025-3-6閱讀:113
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              本應用說明是在µ-Slide ibiPore SiN載玻片內(nèi)創(chuàng)建單層人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的方案。在涂層和細胞接種后,使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)將內(nèi)皮單層暴露于單向?qū)恿骷羟袘ο?。該方案的重點是將µ-Slide ibiPore SiN與使用ibidi pump system泵系統(tǒng)施加剪切應力相結(jié)合。



              ibidi用于研究動態(tài)或靜態(tài)條件下遷移和傳輸?shù)慕鉀Q方案:

              

              • µ-Slide ibiPore SiN

              

              • ibidi Pump System

              

              相關(guān)文件:

              

              •Instructions µ-Slide ibiPore SiN

              

              •Instructions ibidi Pump System

              

              

              1、材料

              

              •µ-Slide ibiPore SiN 0.5μm/20% ibiTreat (貨號:85216-S,ibidi,德國)

              

              •ibidi Pump System泵系統(tǒng) (貨號:10902.ibidi,德國)

              

              •灌流管套裝紅色,15cm,內(nèi)徑1.6mm (貨號:10962.ibidi,德國)

              

              •螺旋式管道夾 (貨號:10861.ibidi,德國)

              

              •人臍靜脈內(nèi)皮細胞,HUVEC,(貨號:C-12203.PromoCell,德國)

              

              •內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(貨號:C-22010.PromoCell,德國),輔以內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基補充混合液(貨號:C-39215.PromoCell,德國)

              

              •Accutase細胞解離液(貨號:A1110501.Gibco)

              

              •IV型膠原蛋白(貨號:354233.Corning)

              

              •標準細胞培養(yǎng)設備(無菌工作臺、細胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、PBS等)

              

              重要提示:在實驗前一天,將所有所需材料(如 µ-Slides 載玻片、培養(yǎng)基和灌流管(套裝)在37°C和5%CO2的培養(yǎng)箱中平衡過夜,這對防止氣泡隨時間產(chǎn)生至關(guān)重要。

              

              2、包被載玻片

              

              •按照生產(chǎn)商的說明,將IV型膠原蛋白涂層溶液稀釋至40µg/mL的最終濃度

              

              •在 µ-Slide 載玻片上涂上一層涂層 (詳細的涂層方案見 µ-Slide ibiPore SiN 使用說明)

              

              •吸干涂層溶液

              

              •用PBS沖洗兩次

              

              •在室溫下晾干 µ-Slide 載玻片,然后再接種細胞

              

              3、制備及接種細胞

              

              •在添加了混合補充劑的內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC

              

              •用 Accutase 細胞解離液處理細胞2分鐘,使其分離

              

              •收集細胞懸液

              

              •離心細胞懸浮液,用生長培養(yǎng)基稀釋以獲得所需的濃度

              

              •計數(shù)細胞,調(diào)整至2x106 cells/ml的濃度,使細胞貼壁后的光學匯合度達到100%

              

              • 將細胞接種到 μ-Slide ibiPore SiN 的下部通道中(細胞播種的詳細說明請參閱μ-Slide ibiPore SiN使用說明)。

              

              •在37°C和5%CO2條件下培養(yǎng)兩小時,讓細胞貼壁。

              

              重要提示:用于繁殖的培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞不應生長到接近100%的光融合。融合的單層進入生長抑制狀態(tài),這會阻止細胞增殖并改變細胞的生理機能。只有在需要單層培養(yǎng)的實驗中,才建議采用100%匯合。

              

              4、灌注

              

              •在相差顯微鏡下控制細胞貼壁的程度

              

              •為清除 ibidi Pump System 泵系統(tǒng)中的氣泡,在連接 μ-Slide ibiPore SiN載玻片前,先讓其運行1-2小時

              

              重要提示:實驗當天如何清除系統(tǒng)中的氣泡,請參閱ibidi Pump System泵系統(tǒng)使用說明

              

              •用 ibidi 螺旋式管道夾或霍夫曼管道夾夾住灌流管的管道

              

              •將 µ-Slide ibiPore SiN載玻片連接到管道上

              

              •緩慢打開夾緊的管道,以盡量減小壓力峰值

              

              •按照下表中的參數(shù)開始灌注實驗。開始時低流量是使細胞適應剪切應力的必要條件

              

              

              5、結(jié)果

              

              

              人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)在 ibidi μ-Slide ibiPore SiN 0.5μm 載玻片中以 10dyne/cm2流體剪切力條件下培養(yǎng)(A)和靜態(tài)條件下(B)培養(yǎng)24小時,窗口大小2mm×2mm,4倍物鏡,相差,比例尺200µm

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