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            上海北諾生物科技有限公司
            中級(jí)會(huì)員·14年
            
    
            
	       
            
            
            
                
                
            
                    
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            中級(jí)會(huì)員·14年
            
        
            
            
            
                                     
            
                        
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            上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門(mén)大廈18樓D座
            
                            
            
                                                     
            
              
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            專(zhuān)題：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)
            2013-7-8　　閱讀(1505)
            

            
							
				
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            將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種：
            1.磷酸鈣共沉淀
            將氯化鈣，RNA（或DNA）和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x*條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。
            2.電穿孔法
            電穿孔通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過(guò)程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。
            3.DEAE-葡聚糖和polybrene
            帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
            4.機(jī)械法
            轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍?zhuān)╞iolistic particle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。
            5. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑
            在優(yōu)化條件下將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí)，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱(chēng)，一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞?，F(xiàn)存對(duì)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來(lái)源于內(nèi)吞體和溶酶體。
            6. 腺病毒載體
            腺病毒由于其基因結(jié)構(gòu)、功能清楚；易于制備、純化、濃縮；宿主范圍廣；感染率高；理化性質(zhì)穩(wěn)定；不整合宿主基因組；遺傳毒性和免疫毒性低的特點(diǎn)，成為RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究中重要的基因載體系統(tǒng)。Ad2和Ad5是目前應(yīng)用zui廣的兩種腺病毒血清型。
            為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：
            1.純化siRNA
            在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過(guò)15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
            2.避免RNA酶污染
            微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。
            3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性
            通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。
            4.避免使用抗生素
            Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)期間避免使用抗生素?？股貢?huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無(wú)血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到*轉(zhuǎn)染效果。
            5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑
            針對(duì)siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類(lèi)型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì)siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
            6.通過(guò)合適的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件
            對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對(duì)照。將不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)照蛋白或mRNA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過(guò)多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。
            7.通過(guò)標(biāo)記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
            熒光標(biāo)記的siRNA能用來(lái)分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來(lái)追蹤轉(zhuǎn)染過(guò)程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來(lái)。 
            
      
            
      
      
            
    
            
    
            
  
            

            
		 







  
    
    				
			

		
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

     
     
     
	 



	
	
	


            
	
            
		
            
			
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