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上海北諾生物科技有限公司
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枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備可以：（1）用于建立枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系；（2）用于其基因改造；（3）用于提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)性能相關(guān)研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 化學(xué)法
- 化學(xué)改進(jìn)法
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 枯草芽孢桿菌168 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | SPI 培養(yǎng)基 EGTA SPII 培養(yǎng)基 檸檬酸鈉 EGTA 氫氧化鈉 KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 MgSO4 葡萄糖 酵母膏 （ NH4 ）2SO4 |
| 儀器、耗材 | 培養(yǎng)箱 培養(yǎng)皿 錐形瓶 紫外分光光度計(jì) 接種環(huán) 離心管 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、試劑配制 1. SP 鹽 0.2%（ NH4 ）2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 檸檬酸鈉。 2. CAYE （100×） 2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培養(yǎng)基 SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。 4. SPII 培養(yǎng)基 SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution（500 ml） （1）0.4% （NH4）2SO4 ：2 g （2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g （3）1.2% KH2PO4 ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121°C滅菌20 min。 6. SP-B Salts Solution（500 ml） （1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g （2）121°C滅菌20 min。 7. 100×CAYE Solution（100 ml） （1）2% Casamino acid ：2 g （2）10% Yeast Extract：10 g （3）121°C滅菌20 min。 8. SPI Medium（20 mL） SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL （1%V）Glucose（50%w/v，115°C滅菌20 min） ：200 μL （1%V）100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium（6 mL） SPI Medium：5.88mL （1%V）50mM CaCl2 ：60μL （1%V）250mM MgCl2：60μL 11. 100×EGTA Solution 10mmol/L EGTA 溶液，溶解時(shí)需加少量NaOH 至pH8.0。 二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。 2. 轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)過(guò)。 3. 第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（168 約4-5 h）。 4. 取0.2 ml 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。 5. 在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。 6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA（DNA 量不能過(guò)高，不超過(guò)5 μg），再于37 °C，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。 |
| 注意事項(xiàng) | 1. 注意儀器用品的干凈和無(wú)菌。 2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，不要使用玻璃試管。 3. 注意測(cè)定OD值，一定要等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期。 4. 保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。 |
