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分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，zui后進行精細分離，得到目的蛋白。本實驗以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。
實驗方法
- 硫酸銨鹽析法
| 實驗方法原理 | 分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，zui后進行精細分離，得到目的蛋白。本實驗以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。 TNF的提取是將發(fā)酵菌體裂解，在一定的條件和溶液中，使被提取的TNF充分釋放出來，經(jīng)離心收集混合液中提取的TNF成份的過程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的雜蛋白，由于蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度主要取決于蛋白質(zhì)分子表面的水分子數(shù)目，即蛋白質(zhì)表面親水基團與水分子形成水化膜的程度和帶電荷的情況，當中性鹽如硫酸銨等加入蛋白質(zhì)溶液時，由于中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱或消失，蛋白質(zhì)溶解度降低，同時由于中性鹽的加入，蛋白質(zhì)溶液的離子強度發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和，更加導致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間互相聚集而發(fā)生沉淀。不同的蛋白質(zhì)由于其帶電性，親水性等性質(zhì)的不同，會在不同濃度的鹽中形成沉淀。依此原理可對混合蛋白質(zhì)進行粗分離。該實驗中利用硫酸銨鹽析除去大部分雜蛋白從而使TNF得到初步純化。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 新型基因重組人TNF |
| 試劑、試劑盒 | 蔗糖 TRIS 鹽酸 乙二氨四乙酸二鈉 氫氧化鈉 STE溶液 Dnase I 脫氧膽酸鈉溶液 |
| 儀器、耗材 | 透析袋 攪拌棒 滅菌鍋 電子天平 燒杯 稱量紙 藥匙 量筒 燒杯 制冰機 |
| 實驗步驟 | 一、試劑配制 1. STE（25%蔗糖 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1 mmol/L EDTA） 蔗糖 250 g 1 mol/L Tris.HCL 10 ml 0.5 mol/L EDTA 2 ml，加水至1 000 ml 115℃，20 min高壓滅菌 2. 1mol/L MgCl2 取 MgCl2 203.30 g，加水至1 000 ml 3. Tris-HCL pH8.5 取Tris 121.14 g 用HCL調(diào)pH至8.5，加水至1 000 ml （12 mol/L HCL約30 ml） 4. 0.5 mol/L EDTA pH8.5 乙二氨四乙酸二鈉 186.12 g NaOH 20 g，加水至1 000 ml 121℃，20 min高壓滅菌 二、操作步驟 1. 稱取菌體重量，按5~10 ml/g菌體加入STE溶液，攪拌至菌體*懸浮。 2. 按0.5~1 mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力攪勻后于4℃環(huán)境中放置20 min。此時菌液呈粘稠狀。 3. 按10 mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的脫氧膽酸鈉（DOC）溶液，用力攪勻。 4. 加入5~10 ml 1 mol/L MgCl2溶液，攪勻后加入約40 μl Dnase I（25 mg/ml）充分攪拌至菌液變稀。 5. 15 000 rpm，4℃離心30 min。 6. 取離心上清，量取其體積，測定蛋白質(zhì)濃度，倒入置于冰浴的燒杯中，邊攪拌邊緩慢加入固體硫酸銨使其達到50%飽和度。待固體硫酸銨安全溶解后，靜置于0℃環(huán)境中30 min。 7. 離心，15 000 rpm，4℃，30 min。取離心上清，量其體積，測定蛋白濃度。 8. 將離心上清裝入透析袋，4℃攪拌在pH8.5 20 mmol/L Tris-Hcl，1 mmol/L EDTA溶液中透析。 加入硫酸銨不論是固體硫酸銨，還是加入飽和硫酸銨溶液，加入時應邊加入邊攪拌，特別注意① 加入硫酸銨要慢，因為太快會引起蛋白質(zhì)發(fā)生共沉淀，加入固體硫酸銨時事先要將硫酸銨研磨成粉末，加入飽和硫酸銨溶液時要一滴一滴地加入；② 攪拌要慢，攪拌劇烈，蛋白質(zhì)溶液容 |
