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實(shí)驗(yàn)試劑
1. L-Leucine，ATP，DTT，焦磷酸鈉(tetrasodium pyrophosphate)和HA-Ultrogel購自美國Sigma公司。
2. [32p]-焦磷酸鈉購自美國杜邦公司。
3. L-[I4C]-亮氨酸和DEAE-SepharoseTM Fast Flow購自英國Amersham公司。
4. 限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自立陶宛MBI Ferments公司。
5. 質(zhì)粒pTrc-99B。
實(shí)驗(yàn)材料
大腸桿菌LeuRS從高表達(dá)大腸桿菌菌株中純化得到
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 突變體LeuRS基因的構(gòu)建
以構(gòu)建的編碼大腸桿菌LeuRS的基因leuS作為模板，利用兩步PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到六個(gè)LeuRS變種酶的基因序列。
一輪PCR反應(yīng)的5’和3’引物：上下游引物分別具有NcoI和HindIII酶切位點(diǎn)，構(gòu)建各突變所用的引物略。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)用NcoI和HindIII雙酶切后，嵌入表達(dá)載體pTrc-99B的NcoI和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)間的切口內(nèi)。得到的LeuRS 6個(gè)變種酶基因的正確性用DNA測序證實(shí)。
2. LeuRS及其變種酶基因的表達(dá)和純化
將含有LeuRS及其六個(gè)變種酶LeuRS-E292K，LeuRS-E292F，LeuRS-E292S，LeuRS-E292D，LeuRS-E292Q，LeuRS-E292A的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到在大腸桿菌菌株TG1中，挑選含有正確質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子至5 mL氨芐-LB液體培養(yǎng)基，37℃，300 rpm振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子至對數(shù)生長期，用0. 5 mM IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)，取出20ul培養(yǎng)液，加入等體積的SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸10分鐘，離心取上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢查轉(zhuǎn)化子中各變種酶基因的表達(dá)情況。將高表達(dá)轉(zhuǎn)化子5 mL菌液轉(zhuǎn)接至500 mL氨芐-LB液體培養(yǎng)基中37℃，300 rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0. 5 mM IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)，收集菌體。將濕菌體懸浮于20毫升0℃預(yù)冷的破菌緩沖液(50 mM磷酸鉀緩沖液，pH6.8，含10 mM β-琉基乙醇，2 mM PMSF，10%甘油)中，冰浴超聲波破菌。將破菌液于4℃，12,000g離心30分鐘后繼續(xù)經(jīng)4℃，150,000g超離心1小時(shí)。取上清液經(jīng)過DEAE-SepharoseTM Fast Flow和HA-Ultrogel兩步柱層析純化。在DEAE-Sephorose CL-6B fast flow純化中使用的線性洗脫梯度為pH6.8的磷酸鉀緩沖液50 mM-500 mM。在HA-Ultrogel純化中使用的線性洗脫梯度為pH 6.8的磷酸鉀緩沖液20 mM-300 mM。收集的含LeuRS以及變種酶的洗脫峰，用PEG 20000濃縮，對10 mM pH 6.8的磷酸鉀緩沖液透析。加入50%0℃預(yù)冷的甘油，保存于-20℃。
3. 蛋白質(zhì)濃度測定
粗抽液蛋白質(zhì)的濃度用Bradford方法測定。純化后的LeuRS以及變種酶的濃度可以通過以下公式計(jì)算得到：1 A280=1.62 mg/ml。
4. 酶活力測定
氨基酸活化反應(yīng)的條件如下：35ul反應(yīng)液中含有100mM HEPES (pH7.8)，10mM KF，10 mM MgCl2，4 mM ATP，2 mM [32P] PPi和1 mM亮氨酸，在37℃保溫，用約4 nmol/L LeuRS起始反應(yīng)，于不同時(shí)間，取出15ul反應(yīng)液，加入200ul淬滅液中(3.5%高氯酸，2%活性炭和0.05 M焦磷酸鈉)停止反應(yīng)，在淬滅液中再加入5毫升10 mM焦磷酸鈉溶液，用Whatman GF/C濾紙過濾以上溶液，收集吸附32P-ATP的活性炭粉末，依次用10 mM焦磷酸鈉(2x5 ml)和95%乙醇(2x5ml)洗滌和抽干，烘干后，投入閃爍液，閃爍液為0.6%2-(4-叔丁基苯-5-(4-雙苯基)1,3,4二唑[溶劑為乙二醇甲醚/甲苯(體積比為6/4)]，計(jì)數(shù)活性炭粉末吸附的32P-ATP的量。氨基酸活化反應(yīng)活力的單位定義為在測定條件下，每分鐘催化1納摩爾PPi形成ATP所需要的酶量。氨基酞化反應(yīng)的條件如下：35ul反應(yīng)液中含有100 mM Tris-HCl (pH7.8)，30 mM KCl，12 mMMgCl2，4 mM ATP，0.1 mM EDTA，0. 5 mM DTT，20uM tRNAleu，0.1mMC亮氨酸在37℃保溫，用約5 nM LeuRS起始反應(yīng)。不同時(shí)間取15ul反應(yīng)液滴在Whatman 3#濾紙上((1.0cm×1.0cm)，放置5秒鐘后，將紙片投入5%三氯中(含有5 mM亮氨酸)，0℃浸泡10分鐘，換2次5%三氯溶液，再用95%乙醇浸泡兩次，烘干濾紙片。投入PPO/POPOP閃爍液((5 g PPO0.25 g POPOP溶解于1L甲苯)，液閃計(jì)數(shù)。氨基酞化反應(yīng)活力單位定義為:在測定條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1納摩爾亮氨酞-tRNAleu所需的酶量。
5. CD光譜和熒光光譜的測定
測定CD光譜所使用的儀器為Jasco J-715型圓二色性儀。蛋白質(zhì)樣品在10 mM磷酸鉀溶液((pH 6.8)中的濃度為0.2 mg/ml，測定溫度為室溫，所用比色杯的光徑為0.lcm。熒光光譜的測定在日本Hitachi F-4010熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行。測定發(fā)射光譜時(shí)，激發(fā)波長為295 nm，狹縫為3 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為300-400 nm。熒光杯的光路長為1 cm。蛋白質(zhì)樣品在10 mM磷酸鉀溶液(pH 6.8)中的濃度為0.1 mg/ml。
